Способ получения 5-дезоксирибомононуклеотидов

(51)Ъ 61 К 37 1 12 Р ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ л. Р 42Н.П. Балабан,.Шевченкоордейагосуд арс т. Уль яноваетельство СССР3/Об 1966.ельство СССР7/107, 1975. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР . ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Киевский ордена Ленинвенный университет им. Т,и Казанский ордена ЛенинаТрудового Красного Знаменивенный университет им, В.Ленина(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНЯ 5 -ДЕЭОК=.СИРИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ из дезоксирибонуклеиновой кислоты, включающийее гидролиз в присутствии нуклеаэпри нагревании с последующим выделением целового продукта, о т л и ч ащ и й с я тем, что, с целью одноврЕменного получения 5 -дезоксирибоди-и 5 -дезоксириботринуклеотвдов,гидролиз осуществляют в присутствиинуклеазы, вЫделенной из бактерии.Изобретение относится к полученик.1биологически актиннын, веществ, аименно 5 -дезоксирибомоно-, 5 - деэоlксирибоди-и 5 -деэоксириботринукле/отидон, которые находят применениев медицине в качестве лечебных препаратов и физиологически активных неществ, н научных исследованиях нкачестве объектов и инструментовисследования, н пищевой промышленности для улучшения вкуса, придания 10аромата мяса и повышения питательнойценности ряду растительных пищевыхпродуктов.Известен способ получения 5 -моно.нуклеотидов нуклеиновых кислот, заключающийся в Ферментативном гидро-.лиэе нуклеиноной кислоты, при этомрасщепление нуклеиноной кислоты осуществляют с помощью Фосфодиэстераз,выделяемых актиномицетатами в культуральную жидкость в ходе Фермента. ции Я .Однако известный способ не позволяет получить целевой продукт с высоким выходом и удовлетворяющей25чистотой.Известен также способ получения5 -дезоксирибонуклеотидов из,деэоксирибонуклеиновых кислот, включающий их гидролиз с помощью нуклеаэ,выделенных иэ печени морских промысловых рыб при 37 оС н течение 24 ч,и при рЯ 7,0 с последующим выделением целевого продукта 2.Известный способ не обеспечиваетодновременноо получения 5 дезоксирибомоно-, 5 -деэокскрибоди-и5 -дезоксириботринуклеотидов.Цель изобретения - одновременноеполучение 5 -дезоксирибоди-и5 -дезоксириботринуклеотидон,г4 рПоставленная цель достигаетсятем, что согласно способу получения5 - дезоксирибомононуклеотидов издезоксири бомононуклеи новой кислоты,включающем ее гидролиз н присутствиинуклеаэ при нагревании с последующимвыделением целового продукта,.гидролиз осуществляют в присутствии нуклеазы, выделенной из бактерии 5 Еи або. щагсеьсеоэ при 25 - 370 С, рЯ 8,1-8,5,времени инкубации 2-18 ч и соотношении исходного сырья и нуклеаэы 1;200,Выделение Фермента иэ культуральной жидкости 4 ЯМЦ дуеаЭсеедВи 211АТССштамм Р 24 осуществляютследующим образом. 5Культуру выращивают на полусинтетической среде в течение 2 сут при274 С в конических колбах с интенсивной аэрацией при перемешивании (накачалках 70-80 об/мин) . Посев производят односуточной культурой израсчета 0,5-1 млн. клеток на 1 млсреды, Состав среды для выращивания,Ъ : глицерин 0,5; цитрат аммония0,5 рКНР 04 1 уМ(Я 0,05)ааСР 0,05 ОСО,006165 гидролиэат .казеина 0,1 1 дрожжевойантолизат 03 при рН 7,5.По окончании выращивания бактериальные клетки удаляют центрифугированием, а из надосадочной жидкостивыделяют нуклеаэу с помощью Фракциониронания сульфатом аммония (90. насыщения) и последующей очистки надвух монообменных колонках,Первая колонка с ДЭАЭ-целлюлозой.Проводят пропускание ферментногораствора (сульфат-аммонийная Фракциянуклеазы после диализа и центрифугирования) через колонку, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером,рЯ 5,2. При этом весь ферментныйбелок не задерживается колонкой, наней остается большая часть балластных белков, содержащихся н сульфатаммонийной Фракции наряду с нуклеазой.Вторая колонка с Фосфоцеллюлюэой.Проводят пропускание ферментногораствора (Фракция после очистки наДЭАЭ-целлюлозе) через колонку, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатнымбуфером, рй 5,2. В этих условияхнуклеаэа спецнфически сорбируетсяионообменником, а большая частьбалластных белков не задерживаетсяколонкой и выходит иэ нее причнанесенин и последующей промывке буфером. Элюция Ферментного белка осущестнляется 0,2 М натрий-ацетатнымбуфером, рН 6,2,В процессе очистки нуклеазы нсульфа:-аммонийной фракции актвн летьфермента контролируют по начальнойскорости образования кислоторастнори;мых продуктон гидролиза дезоксирибонуклеиновой киолоты (ДНК) под влияниемвыделяемой нуклеазы. За единицу. актив,ности принимают количество фермента,которое дает унеличение поглощенияультрафиолетовых лучей при 260 нмпродуктами гидролиэа ДНК, растворимыми н 4% НЖ 04, равное 1 оптическойединице, н пересчете на 1 мг ферментаза 1 ч инкубации при 37 С (ед/мг/ч,А 260) . Инкубационная проба объемом1 мл содержит 1 мг ДЯК; 01 М трисНС 1 буФер, рЯ 8,5; 0,007 М Му.Бс 4 и0,1 мл ферментного раствора в такомразведении, которое обеспечивает начальную скоро;ть прохождения ферментативного гидролиэа субстрата,П р и м е р, Берут 10 мг ДЯК тимуса крупного рогатого скота (или изгюбого другого источника), растворяют в 10 мл дистиллированной водыи добавляют 8 мл 0,25 М тоис-НС 0.буфера,рЯ 8,5, содержащего 0,0175 ММ 504 . Затем вносят 0,1 мл растворафермента, разведенного таким образом,чтобы йа 1 мг ДНК н инкубируемойпробе приходилось 2500 ед, активностиФермента (на 1 мг ДНК вносят 5 мкгнуклеазы, обладающей удельной актив"нсстъю 5000001. Гидрслиэ проводят при 37 С ч или при 25 С 18 ч (при этом соблюдаются условия исчерпывающего гидролиза субстрата в присутствии избыточного количества. Фермент- ного препарата), По окончании про цесса ферментативного гидролиза ДЯК гидролизат прогренают при 90 С 15 мин для инактивации и денатурации фер-. ментного белка, а появившуюся при этом легкую мутность удаляют центри фугированием (5000 об/мин, 15 мин) .Разделение смеси 5 -дезоксирибонуклеотидон осуществляют известным способом, например методом ионообменной хроматографии на колонках. 15 Берут 18 мл гидролизата ДНК, попученного описаннич способом,что сос-. тавляет 300 оптических единиц поглощающего ультрафиолетовые лучи при 260 нм материала 1 и наносят на ионообменную колонку (2 х 12 см, объем 38 мл), содержащую ДЭАЭ-целлюлозу в ацетатной форме, рН 4,7. Колонку промывают дистиллированной водой, затем 7 М мочевинсй, приготовленной на натрий-ацетатном буфере, рЯ 4,6 . (в 1 л раствора 7 М мочевины содержится 25 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера, рЯ 4,7), до снижения рн вытекающего из колонки буФера до .6,2-5,3, По окончании промывки 5-дезоксйрибонуклеотиды элюируют с колонки в порядке увеличения их полимерности градиентом возрастаю+ щих концентраций)(ОСВ, Объем градиен" . та (750 мл 7 М моченины+натрий-аце" 35 тат, рЯ 4,7,+ ОМЙаС 1) +(750 мл 7 М моченины + натрий-ацетат, рН 4,7,. + + 0,3 М НаСВ) . Вытекакщий из колонки элюат собирают по фракциям и анализируют,спектрофотометрически при. 40 60 нм. Объем фракции 15 мл, скорость элюции 150 мл/ч, С колонки элюирова - но пять фракций пиков веществ, поглощающих ультрафиолетовые лучи при.260 нм. В элюате в сумме определено 94-97 материала от количества, нанесенного на колонку. При увеличении. ионной силы элюирующего раствора дс 2 М йаСФ (после окончания градиента) с колонки не снимается дополнительно материал, поглощающий при 260 нмКаждая из пяти фракции неществ(н отдельчости) обессоливается от мочевины и МаС 6 в колонке с ионооб-. менником и подвергается анализу ихарактеристике., 55Обессоливание полученного матерка" ла проводят следующим образом. ВФракции, составляющие каждый пик, объединяют пс пикам, разводят 3-.5 60 объемами дистиллированной воды и доводят рН до 8,0. Затем каждый пик (в отдельности) пропускают через, ДЭАЭ-целлюлсзную колонку (в карбснатной Форме) . Объем колонки для каждого 5 пика подирают из расчета, что0,2 ммоль нуклеотидного материаласорбируют на.колонку объемом 90 мл.Колонку промывают большим объемомдистиллированной воды (5 объемон колонки), затем 0,02 М карбонатом аммония (рН 8,4) до отсутствия ионов хлора в вытекающем буфере (проба с нитратом .серебра) . Затем нуклеотидыэлюируют с колонки 0,7 М карбонатомаммония (рН .8,4) . Обессоленный элюатнуклеотидных Фракций концентрируютпод вакуумом на роторном испарителепри температуре водяной бани не выше30 С (или лиофильно высушивают) . Косухому остатку добавляют небольшойобъем ноды .(3-5 мл) и снова высуши-.вают тем же,образом. Процедуру повторяют до полного удаления карбонатааммония (обычно 3 раза) .Обессоленные фракции идентифицируют по порядку элюции и ионной силеснятия каждой Фракции с колонки, псотношению концевого фосфата.к общемуфосфору, по снижению отношения нели-.чины оптической плотности при 260 нм(Е) к Фосфору (Р) с повышением длиныалигбнуклеотида, по спектрам поглощения н .ультрафиолетовой области(220 - .300 нм); по наличиюдезоксирибозы в каждом пике, определяемом сдифениловым реактивом,Результаты анализа материала,элюированного с ДЭАЭ-целлюлозы прихроматографическом разделении гидролизата ДНК, полученного с помощьюнуклеазы 5 еггобд вггсезсепь штамм Р 24,приведены в таблице.Результаты, аналогичные приведенным в таблице, получают при гидролизе 1 г, а также 10 г ДНК при соответствующем увеличении объемовинкубационной смеси и количествануклеазы, используемой для ферментативного расщепления субстрата, атакже при соответствующем увеличенииобъема колонки с ионообменником, ис"псльзуемым для Фракционированиягидролизата ДЯК и объемов всех рабочих буферных растворов. Идентичные результаты получены на всех испытанных препаратах ДЯК1отечественного производства, возможно широкое применение предлагаемого способа получений 5 - дезоксирибонуклеотидов в промьпаленных масштабах с использованием в качестве субстрата ДНК отечественноГо производства. /Полученные в результате хроматографическ ого разделени я гидролиза та ДНК.на ДЭАЭ-целлюлозе фракции, пред,ставляющие собой смеси моно-, ди-и тринуклеотидов,при необходимости могут быть легко разделены на индивидуальйые компоненты внутфй каждои фракции с помощью ионообменной хроматс-.1053832 Количествоматериалав пике,от нанесенного Порядоквыходапиков слови Ионная си- Е/Рла снятияпика, ммоль,я аСО Наличие арактердезокси- спектрарибо Идентификация пика 1 4;4 2 3,3 1 3-20 27, 6-36,2. Нет Р Нет Яе нуклео.Примеси в ДЯКтидныйНуклеотид-Яуклеозиды,ный основания Есть 20,3 49,2-65,4 9,989. 1,12 71,8-87,7 8,205 1,98 94,2-116,6 7,782 3,21 5 -мононуклеотиды5 -динуклеотиды/5 -тринуклеотиды 25,6 27,0 Составитель В. БрусйловскаяРедактор ЛкАлексеенко Техред И.ГергеЛь Коореккор К.ПккккоПодпис ное Заказ 8961/4 тираж 713ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий .113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП 1 Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4 графин наДауэксе в известных условиях. Кроме того, фракции ди-и тринуклеотидов могут быть подвергнуты ферментативному гидролизу в известных условиях с целью получения из них индивидуальных мононуклеотидов. 5Иэ приведенных данных следует, что использование 5 -эндонуклеазы ,Йеггаба щагсеэкез,штамм 9 24 для гидро- лиза промышленннх препаратов ДНК с целью получения 5 к-дезоксирибонукле отидов по предлагаемому способу экономически выгодно, так как указанную нуклеазу выделяют из культуральнай жидкости бактерий 5 еггаба юагсеэсепв штамм Р 24, который является чверх- ) продуцентом данного Фермента. Благодаря чрезвычайно высокой продуктивности данных бактерий гарантируется получение в больших количествах препарата нуклеазы, активность которого 20 в 20 и более раз превосходит активность препарата панкреатической 5 ДНКазы. Высокая активность нуклазыбеггабааагсебсеяэ, штамм 9 24((500 тыс.сп, ед/мг) позволяет исполь"зовать очень малые количество фермента для гидролиза ДНК (на 1 г ДЯКрасходуется 2,5 млн ед. активности,что составляет около 5 мг ДЯКаэы), агидролиэ проводить в экономичесскирентабельных условиях и получать высокочистный целовой продукт с высокимвых одом . кСуммарный выход отдельных изоплит 5 -деэ оксирибонуклеотидов, полученных по предлагаемому, способу, составляет 95-98 от количества кислоторастворимого материала гидролизата (80-85 составляют индивидуальные фракции, а 15-20 содержится в зонах перекрытия пиков при их раздеенин на ионообменниках), Фракции 5 -дезоксирибонуклеотидов характеризуются высокой чистотой и гомогеыностью, о чем свидетельствует симметричность пиков при монообменной хроматографии, а также результаты спектрального и химического анализа фракций.