Способ получения диагностикума для выявления антидигоксиновых антител

. Коинстиям хикрвский меди- гова ательский испытани и 2-й Мос рственный Н,И.Пиро о . СССР ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Научно-исследовтут по биологическиммических соединенийордена Ленина госудацинский институт им,(56) 1. Авторское свидетельстйо заявке 9 3497653/28-13,кл, А 61 К 31/59, 06,10.82,3(Я) А 61 К 31/59) 6 0 У А 61 В 5/00(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИ КУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИДИГОКСИНОВЫХ, АНТИТЕЛ путем взаимодействия реакци онноспособного производного дигоксина с эритроцитами .барана, о т л и ф ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения чувствительности диагностикума, в качестве реакционноспособ" ного производного используют зпоксид дигобксина в количестве (2,0-2, 5)к 10 моль на (1,8-2,0 10 зритробцитов и процесс проводят при рН 7,5-8,01033139 а. Н Изобретение относится к способу получения диагностикума, который может найти применение в медицине и биолОгии для выявления иммунного ответа на дигоксин и рефрактерности застойной недостаточности кровообра, щения при ишемической болезни сердца в кардиологии.Известен способ получения диагноС . тикума для выявления антидигоксиновых антител, заключающийся в том, что . 10 дигоксин окисляют периодатом лития и подвергают взаимодействию с эритроцитами барана при рН 7,0-7,4 и соот ношении окисленное производное дигоксина: эритроциты(0,5-0,6) 10 моль8 2 О). 101 сС помощью диагностикума, полученного этим способом, удается выявить. антидигоксиновые айтитела у 65 больных с застойной недостаточностью О кровоОбращения, длительное время леченных сердечнми глюкозидами, в том числе и дивоксином, причем титры антител колебались от 1:4 до 1:64,Недостатком этого способа является невысокая чувствительность диагности;кума.Целью изобретения является увеличение чувствительности днагностикумПоставленная цель достигается тем, что согласно способу получения Зо . диагностикума для выявления антидигоксиновых антител заключающемуся во взаимодействии реакционноспособного производного дигоксина с эритроцитами барана (ЭВ), в качестве реакционноспособного -производиойе используяю эпоксид дигоксина в коли. честве. (2,0-25) 10 фжоль на (1,8-2,0)10" эритроцитов и процесс ведут при рН 7,5-8,0. 1Используемый в качестве реакционно способного производного эпоксид дигок. сина получают эпоксндированием дйгоксинам -хлорнадбензойной кислотой. Полученный эпоксид дигоксина без выде ления инкубируют с эритроцитами при 20-25 С и рН 7,5-8,0. Слабощелочная среда необходима для лучшего протекания реакции эпоксида дигоксина с белковыми компонентамк мембраны эритроцита. Повышение рН приводит к лизису и гибели эритроцитов. В этих условиях в реакцию вводят (2,0"2,5) х 10 смоль зпоксида дигоксина на (1,8-2,0) 10 "ц эритроцитов, что в четыре раза превышает соотношение исходных компонентов в известном спо собе получения днагностикума периодатным обкислением. Введение более 2,5 10 моль эпоксида дигоксина приводит к лизису, агглютинацин и гибели эритроцитов, Ковалентное связывание эпоксида дигоксина с белковымн компонентами мембран эритроцитов протекает по схемеО )1033139 Номер больНомербольного ного предлагаемым,известнымс 26. 1:16 1 ф 32 1:4 1:44 1:15 1:64 29 1:16 116 1;16 1:16 1;8 30 114 1:4 1:4 1:16 1:4 32-. П Р й и е р 1. К раствору 8 иг,10-моль). дигоксииа в 1,5 мл диоксана и 0,03 мл зтилеигликоля добавляют раствор 2 мГ и-хлорнадбен войной кислоты в 0,5 мл диоксана, выдерживают 1 сут в темноте при 20( 5 25 С и добавляют по каплям и при перемешивании к 4 ил 100-ных (1 упакованных) ЭБ сусцецдированиых в 40 мл забуференного трио-буфе. рой Физиологического-раствора при 10 рН 8,0. Реакционную массу выдерживают 1 ч при 20-25 С и трижды отмывают эритроциты физиологическим раствором до получения прозрачного супернатан" та. 5П р и и е р 2, Проводят опыт, как в примере 1, на используя 6,4 мг (810 моль) дигоксина и 1,6 мг й-хлорнадбенэойной кислоты.П р и и е р 3. Повторяют пример 1, но берут 7,2 мг (9 10 моль) дигоксина и 1,8 мг и- хлорнадбензой-, най кислоты.П р и и е р 4. Титры антндигок- синовых антител определяют реакци-. ей пассивной гемагглютинации. Для этого в каждую лунку микротитратора вводят по 0,025 мл Физиологического раствора. Затем в пррвую лунку вно-. сят 0,025 мл анализируемой сыворотки крови больных, которую предваритель- ЗО но декомплементируют при 57 С в течение 40 мин, Раститрование сыворотки проводят последовательным переносои иэ каждой предыдущей в каждую последующую по капле раство ра. Затем в каждую лунку добавляют . по капле 1 Ъ-ной суапензии эБ, ковалентно связанных с дигоксином (диагностикум, полученный в примере 1) :,и.пластины инкубируют 2 ч в термо" 4 Титр антидигоксиновыхантител при использова-нии диагностикума, по-,лученного способом известным предлагае-,стате при 37 С. В качестве контроль ных опытов проводят аналогичные реак" ции исследуемых сывороток с нормаль-. ными ЭБ. Кроме того, излучают возмож. вость неспецифической агглютинации, сыворотки сенсибилиэированных дигоксином зритроцйтов. Агглютинацию зритроцитов оценивают визуально по характеру асадка в лунках. Последнее разведение. сыворотки, при котором наблюдается агглютинация, принимают за титр антител при отсутствии агглютинации вконтрольных опытах, По этой метадйке в клинических условиях выяв" ляют титры антидигоксиновых антител в сыворотке крови 64 больных с застойной недостаточностью кровообращения, длительное время леченных сер дечными гликозидами, в том числе дигоксином.Полученные данные представлены в таблице. Таким образом, с помощью диагнастикума, полученного предлагаемымспособом, по сравнению с диагностикумом, полученным известным способом,удается существенно увеличить(на 17,5) количество больных, у которых выявлены антидигоксиновыеантитела. Кроме того, увеличиваетсячувствительность определения титраантидигоксиновых антител на 1-2 раз 4ведения,Предлагаемый способ полученияпиагностикума прост в исполнении,ве требует применения дорогостоящегорборудования и реактивов.Поэтому он может найти широкое применение в клиниках страны для выявления рефрактерности застойной недостаточности кровообращения при ишемичеакой болезни сердца. Титр антидигоксиновык антителпри использовании диагностикума, полученного способом1033139 Продолжение таблицы Номерболь"ного Титр антидигоксиновых антителпри использовании диагностикума, полученного способом Номербольного Титр антидигоксиновыхантител при использовании диагностнкума,полученного способом известным предлага- емым предлагаемым инзвестным 1".32 1 ф 8 33 34 1:4 1:8 14 35 132 118 116 1 г 8 10 1:4 18 1:32 37 1:64 132 12 1:16 38 13 1:8 1:4 39 14 40 1 з 32 1: 1.6 1:4 15 132 1:64 41 116 1:16 20 1:32 1:8 21 1:8. 58 1;4 1:8 ф 49 1:4 59 1:4 116 1:16 50 60 1:4 1:64 1:32 52 62 1:4 1:4 53 1:64 63 1:16 1:8 64 1:16 Составитель О.СкородумоваРедактор Т,Шарганова Техред Т.фанта Корректор В,Бутяга 1:16 1:16 1:32 Заказ 5467/7 Тираж 713 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП фПатентф,. г,ужгород, ул,Проектная,4 1:16 1:64 1:64 1:16 1:64 1:32 1:54 1:16