Способ определения с-концевых аминокислот в пептидах

СОЮЗ СО х й 3/6 ОСУДАРСТВЕННЫЙПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕ ЕТ СССРИ ОТКРЫТИЙ НИЯ ОП СТОУ ю одно- С-конце" инокис" ой карбокдобавляют оотнимаюое произ-А.В,Ев ре чаю е дие малеи до ид ИСАНИЕ ИЗ Н АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬ(71)Всесоюзный кардиологический научный центр АИН СССР(56) 1, АаЬ 1 ег к,Р. Епкув 1 с Ьудго.1 ув(з ю йЬ СагЬохурер 11 дазез. ИеЮ.Епеув., 1967, т. 11,р, 155-166.2. Й 1 п С., ГгаепМе 1-Сопгай Н.Ое 1 егщ 1 пай 1 оп от йега 1 па 1 ая 1 поас 1 дзЬу. Ьудгаг 1 поуз 1 з, Ае, СЬ. 5 ос.,1955, т. 77, р,5882-83 (прототип),(5 Ц (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-КОНЦЕВЫХ АМИНОКИСЛОТ В ПЕПТИДАХ путемрасщепления пептидных связей с последующим определением аминокислотного состава пептида, о т л и ч а ющ и й с к тем, что, с цельвременного определения двухвых аминокислот, включая амготы с замещенной С-концевсильной группой, к пептидудиенофилы в присутствии водщего агента, затем полученнводное гидролизуют, сопоставляютисходный аминокислотный состав петида и полученного производного ипо степени уменьшения содержаниянокислот в производном пептида опделяют их С- концевое положение.2, Способ по и. 1, о т л ищ и й с я тем, что в качествфилов используют производныеновой или Фумаровой кислот.3, Способ по п.1, о т л и ч ащ и й с я тем, что в качестве воотнимающего агента используют ангриды кислот.Изобретение относится к химии, в частности к установлению структуры пептидов.Известен способ определения С"концевых аминокислот с помощью ферментов, например карбоксипептидазы 1.11.Однако этот метод непригоден для определения С-концевых аминокислот в пептидах с устойчивой пептидной10 связью например пролилпептидов.Кроме того, карбоксипептидаза не способна отщеплять С-концевые амиды, например глициламид.Известен также способ определения С-концевых аминокислот в пептидах15 путем расщепления пептидных связей с последующим определением аминокислотного состава пептида. Это достигается с помощью гидразиноли 20за 1, 2.Недостатком этого метода являетсяневозможность определения С-концевойаминокислоты, если она находится вформе амида. Кроме того, способ позволяет определять только одну С-концевую аминогруппу.Целью изобретения является одновременное определение двух С-концевых аминокислот, включая аминокислотыс эамещенной С"концевой карбоксиль- З 0ной группой,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определенияС-концевых аминокислот в пептидахпутем расщепления пептидных связей З 5с последующим определением аминокислотного состава пептида, к пептидудобавляют диенофилы в присутствииводоотнимающего агента, затем полученное производное гидролизуют, сопоставляют исходный аминокислотныйсостав пептида и полученного производного и по степени уменьшения содержания аминокислот в производномпептида определяют их С-концевое . 45положение.Кроме того, в качестве диенофиловиспользуют производные малеиновойили фумаровой кислот. В качестве водоотнимающего агента используют ангидриды кислот.гд Й , К - радикалы аминокислотныхостатков на С-конце пептида;Й, Йд+заместители диенофилов.Две концевые аминокислоты входят в состав образующегося устойчивого к гидролизу гетероциклического соединения. При этом вследствие прохождения реакции С-ацилирования промежуточно образующегося оксаэального производного пептида, необратимой модификации в большей степени подвергается С-концевой остаток. Реакционную смесь после гидролиза упаривают и определяют аминокислотный состав на анализаторе: Вследствие необратимой модификации двух С-концевых аминокислотых остатков, содержание их в гидролиэате уменьшается, что отражается на аминокислотном составе.Гидролиз исходного пептида позволяет получить его аминокислотный состав. По сопоставлению исходного аминокислотного состава пептида и по лученного, судят о С-концевых аминокислотах.Аминокислотный анализ гидролизатов проводят на приборе "Лаботрон"фРГ). Данные, подтверждающие воспро изводимость способа, приведены в таблице. е Способ осуществляют следующим образом.Пептид подвергают взаимодействию с диенофилами, в качестве которых используют производные фумаровой или малеиновой кислот ( нитрилы, ангидриды ) в присутствии водоотнимающих агентов-ангидридов кислот. Реакционную смесь гидролизуют кислотами или щелочами. При этом расщепляются все пептидные связи, кроме необратимо модифицированных, входящих в состав гетероциклаН На)НО 4 фСООН+МН С -СООН+1 ьиА 1 а 1.еп1,00 1,01 РЬ 11,01 фумаронитрил Трифторуксусный ангидрид 3,25 1,21 1,00 Иалеиновыйангидрид фосфор треххлористый 6,54 3,94 1,00 То же Изобутилхлорформиат 1 4 1,00 Е-А 1 ау-еп-ОН 61 у Ееп1,00 1,08 А 1 а Трифторуксус" ный ангидрид Иалеиновыиангидрид 1,61 3,65 1 02 1 00 Уксусныйангидрид То же Н-С 1 у-РЬ 1-еп-йН Рп 1 еп 1,00 1;00 1,00Опыты проводят при выдерживании реакционной массы при комнатнойтемпературе в течение 4 сут. П р и м е р 1, Смешивают 2 мг (5 мкмоль амида фенил-алайил-аланил"лейцина 10 мг 1100 мкмольУ малеинового ангидрида, 2,8 мг (20 мкмопь) треххлористого фосфора и выдерживают 12 ч в эапаяной ампуле при 100-120 фС. Ампулу охлаждают, вскрывают, добавляют 05 мл 6 11 соляной кислоты, запаивают и выдерживают 24 ч при 105 фС. фа 1 идролизат упаривают и определяютна анализаторе аминакислотный состав.Получают: РЮ 6,54; А 1 а 3,9411.еп 1,00. Гидролиз исходного пептидадает: РЫ 1,01; А 1 а 1,00; 1.еп 1,00. зз По разнице аминокислотного составаопределяют, что С-концевой аминокислотой является лейцин 1 наибольшее1019336Метод может быть использован вслучае определения С-концевых амидови эфиров пептидов, поскольку уста"новление С-концевой аминокислоты известными методами затруднено, Крометого, предложенный метод позволяетопределять два концевых аминокислот,ных остатка, что важно при установ"ленни структуры пептидов, поскольку сокращает время и упрощает процедуруопределения амииокислотной последовательности. Б Способ достаточно прост, исходные реагенты доступны, аминокислотные анализаторы, необходимые для определения количества аминокислот выпускаются отечественной промышленностью. Составитель Е,ЖитниковаРедактор А.Вишкина Техред А.Бабинец Корректор Е.Рошко ЕЕеввеВЕвавеееЕ Заказ 3693/38 Тираж 813 . ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д, 4/5ю юВ аЧ е а е е а а ае е ее Е юФилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4