Способ получения иммобилизованного трипсина

Авторызобретеии Г, шмелева"-". ф 33 д 2ктябрьской Революции и ощщм,;.г:мени технологический мыалахухЛенсовета Янкевич, Л. В. Пономарева, Ви В. И. Яковлев кий ордена Красного 3 нинград удового) Заявител ЧЕНИЯ ИИИОБИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИН2Изобретение относится к ферментной Недостатком данного способа, огтехнологии и может быть использовано. раничивающим практическое применение, для получения ферментных производ- полученного иммобилизованного ферных на основе т ипсоснове трипсина. мента, является то, что целевой продукт получают в форме сильно оводнен"В медицинской практике широко ис-ных гидросиликагелей, имеющих малую пользуется трипсин вы еляемый изу р , деляемый из твердость и большой объем. Активность поджелудочной, железы крупного рога- препарата по низкомолекулярному син" того скота ля лечения э, д ения ран и ожогов тетическому субстрату - бензол- аргизаболеваний кишечно-желудочного трак- нинзтиловому эфиру (ВАЕЕ).составпята. Действие . этого препарата крат": ет 65.ковременно, так как он в организмечеловека сразу подвергается действию Наиболее близким к изобретению по литических и протеолитических фер- технической сущностй является способ ментов. получения иммобилизованного трипсинаПролонгация действия фермента воз- путем введения фермента в золь поли-. можна при использовании иммобилизо- кремниевой кислоты с последующей быСтванных форм. рой кдагуляцией золя в гидрогель иИзвестен способ получения иммоби-.:. дегидратацией полученного продукта лизованного трипсина связыванием фер-ро до ксеросиликагеля. В указанном спомента с поликремниевой кислотой, взя- собе отмечается сохранение активнос" той в форме золя с дальнейшей коагу ти по низкомолекулярному субстрату ляцией золя до стадии гидрогеля и (ВАЕЕ) до 34 от активности нативно"го фермента и полная потеря актив99455 ности по высокомолекулярному субстра" ту 2 .Это является следствием стеричес" ких затруднений диффузии высокомолекулярных субстратов в геле.Недостатком известного способа являются отсутствие активности по высокомолекулярному субстрату получаемого данным способом иммобилизованного трипсина и невозможность использова р ния его в конкретных технологических процессах.Цель изобретения - сохранение активности иммобилизованного трипсина по высокомолекулярному субстрату, 15Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованного трипсина, заключающемуся в связывании фермента с поли- кремниевой кислотой с последующей дегидратацией продукта, поликремниевую кислоту используют в Форме гидрогеля, процесс ведут в присутствии ионов кальция, а дегидратацию осуществляют в течение 6-8 ч до остаточ ной влажности 12-15/.Проведение процесса в присутствии ионов кальция стабилизирует активность получаемого продукта, а время дегидратации 6-8 ч, обеспечивает именно такую скорость обезвоживания препарата, которая приводит к медленному структурированию гидрогеля и прочному закреплению Фермента в нем.Предлагаемый способ позволяет35 получить ферментнь 1 й,препарат, сохраняющий активность до 20 по высокомолекулярному субстрату (казеину) от активности нативного фермента, стабильный при хранении за 90 сут . хранения при +4 С он потерял 153 своей первоначальной активности, время его полужизни (время, характеризующее активное действие фермента на субстрат)С 2 = 34 ч.45Синтез гидрогеля силикагеля осуществляется нейтрализацией водного раствора силиката натрия смесью минеральных кислот до величины рН 4,0 с последующей коагуляцией золя в гидрогель в течение 2 ч и промывкой50 полученного носителя дистиллированной водой до отсутствия хлор-ионов в промывных водах. 6 4Получение ферментного препаратаосуществляется при контакте раствораэнзима и гидрогеля в течение 14-16 чв присутствии ионов кальция с последующим высушиванием полученногопрепарата до влажности 12-154.П р и м е р 1. 25 г гранулированного гидрогеля силикагеля заливают25 мл раствора трипсина концентрацией 5 10 г/мл в фосфатном буфере0,05 м рН 7,6,содержащем 10М раствор хлорида кальция. Фиксирование осуществляется при 1.С в течение 14 чпри легком перемешивании. Далее контактный раствор сливают, препаратденатрируют при 37 ОС в течение 6 чпри вентиляции до остаточной влажности 153, промывают фосфатным буфернымраствором и сушат. Хранят полученныепрепараты в холодильнике. Активностьпо казеину полученных образцов составляет 203 от активности Фермента, взятого для иммобилизации, и колеблетсяв пределах 10-15 ПГ/г сухого .носителя,П р и м е р 2. Аналогично примеру1 получают гидрогель силикагеля сфиксированным Ферментом. Полученныйпрепарат дегидратируют при 37 С в течение 8 ч при вентиляции до остаточной влажности 123. Промывают фосфатным буферным раствором и сушат, Хранят в холодильнике.Для исследования пролонгирующихсвойств иммобилизованного трипсина2 г полученного сухого препаратаобрабатывают в течение 1 ч модельюжелудочного сока раствор пепсинапри рН 2,4. Далее определяется остаточная протеолитическая активностьна носителе, она составляет 533 отактивности необработанного препарата.Эти данные свидетельствуют о том,что трипсин лишь частично разрушается под действием желудочного сока.Стабильность полученного препаратав процессе гидролиза субстрата при30 С на порядок выше стабильностинативного фермента. Она составляет34 ч, что соответствует периоду действия при его использовании.В таблице приведены свойства ферментного препарата в сравнении с прототипом и нативным ферментом.т т Стабильность при протеолизе (.2 ) Активность,4от нативногоФермента (показеину) Стабильностьпри хранении Пролонгация,Ф от исходной активнос"ти Препарат Нативный Фермент 100 3 ф 1 Не стабилен 0 Фермент включенный в золь 1 прототип) Стабилен О фермент, включенный в гидрогель 20 Стабилен 53 формула изобретения Составитель О. СкородумоваТехред С.Мигунова Корректор И. 18 улла Редактор М. Дылын Заказ 565/7 Тираж. 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, И, Раушская наб., д. М 5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Из данных таблицы. видно, что включение трипсина в структуру гидрогеля силикагеля позволяет получить активные препараты прологниро ц ванного действия. Условия процесса иммобилизации исключают применение химических реагентов и тем самым какое-либо модифицирование белка. Предлагаемый метод позволяет получить препараты, сохранение активности которых по высокомолекулярному субстрату достигает 203, что является высоким показателем для препара- тов, полученных методом включения в гель. Включение в структуру предохраняет препарат от действия других литических энзимов и микроорганизмов. Инертность и нетоксичность носителя делает возможным использование препарата в медицине.Препараты, полученные методом включения в структуру геля являются дешевыми и удобными в обращении, Дешевизна полученных препаратов определяется стоимостью исходных реагентов. Способ получения иммобилизованного трипсина путем связывания Фермента с поликремниевой кислотой с последующей дегидратацией продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сохранения активности иммобилизованного трипсина по высокомолекулярному субстрату, поликремниевую кислоту используют в форме гидрогеля, процесс ведут в присутствии ионов кальция, а дегидратацию осуществляют в течение 6-8 ч до остаточной влажности 12- 15.35 Источники информации,принятые во внимание, при экспертизе. 1. Патент Великобритайии1 Г 1267685,кл. С Н 3, опублик. 1972.2. Р. 1 оЬпзоп, ТИЬае 1 еу нопсне Озе оГ Ро 1 ущег 1 ц 1 пд 5111 са Уе 1зузйеаз .Гог Тите 1 епоЬ 11 гай 1 оп оГТгурз 1 пн ,1. оГ Со 11 апд пйегГасеЬс 1 епсе, 1971, чо 1. 37 а:У 3557 563