Способ получения иммобилизованных ферментов

(21) 242626523 0заявкиЗдявл 51) М. Кл.зС 076 о 06.12.76 инснпем с прис Государственный комите 23) Прпоритс(088 15) Дата опубликован описания 30.03.7 2) Авторы изобретен атэ, Л, И. Валуев и Л, Е. Кото) Заявитсл кий ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знаменосударственный университет им. М. В. Ломоносова ос(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТДанное изобретенис относится к способу получения иммобилизованных ферментов, которые находят широкое применение в тонком органическом синтезе, мсдпцпнс, пищевой промышленности.дВ литературе описаны различные способы мобилизации ферментов на носителя,:. Известны способы иммобилизации путем адсорбции фермента на носителях с высокоразвитой поверхностью, а также путем 10 включения фермснта в различные гслсвыс структуры 1.Недостатком таких способов является малая прочность связи фермента с носителем, в результате чего фермент в процессе 15 эксплуатации может диффундировать с носителя в раствор.Известны также способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании фермента с предварительно активирован ным носителем. Активация носителя необходима для создания на нем функциональных групп, способных взаимодействовать с молекулами фермента. Наиболсс распространенным способом активации носителя 2;, является обработка носителя циднгалогснидами в щелочной среде 1, Недостаток этого способа активации заключается в ТОМ, 1 ТО ОП ПРИМСНИМ ТОЛЬКО ДЛЯ ДКТПВД- цип носителей, содержащих оксигруппы,; 30 используемое для активации соединение является отравляющим веществом.В последние годы развивается способ иммобилизации путем привитой сополимсризации полимерного носителя с мономером под действием ионизирующего излучения с последующей обработкой полученного при этом привитого сополимера активатором и раствором фермента 2). Так, на полипропилен под действием у-излучения Со" прививают и-нптростирол. Гомополимер и-нитростирола отделяют от привитого сополимера экстракцией смесью хлороформа и бснзола в течение 48 ч. Привитой сополимер затем обрабатывают в течение 24 ч метанолом для удаления бензола и сушат в вакууме. Нитрогруппы полученного привитого сополимера восстанавливают в аминогруппы диспергированисм сополимера в димстплформампдс п обработкой хлоридом олова и соляной кислотой при 100 С в течение 18 ч. Аминогруппы получаемого после восстановления сополимсра затем превращают в изотиоцианатные или дпазогруппы, способные реагировать с молекулами фермента, в качестве которого использовали трипсин. Иммобилизацию трипсина на получаемом носителе можно также осуществлять с помощью бифункциондльного си динения, способного реагировать с ами 654620ногруппами носителя и аминогруппами фер.мента. Недостаток указанного способа заключается в трудоемкости и длительности получения конечного продукта (более 4 суток) и низкой протсолитической активности (13% от исходной) иммобилизованного трипсина.Целью предлагаемого изобретения является упрощение процесса и повышение активности иммобилизованных ферментов.Эта цель достигается за счет активации полимерного носителя привитой сополимсризацией аллиламина в присутствии фосфорной кислоты.В соответствии с изобретением описывается способ получения иммобилизованных ферментов, заключающийся в том, что процесс позволяет путем привитой сополпмеризации на поверхность инертного полимерного носителя под действием ионизирующого излучения аллиламина в присутствии фосфорной кислоты с последующей обработкой привитого сополимера активатором, например глутаровым альдегидом, и раствором фермента.Реакцию привитой сопопимеризации аллиламина обычно проводят либо в массе, либо в среде полярных растворителей, например, воды, спиртов, кетонов, простых и сложных эфиров и т. п., под действием ионизирующего излучения, например у-излучения или смешанного излучения ядерного реактор а, а мол ярное соотношение аллиламин - фосфорная кислота равно 1: : 0,1 - 10. В качестве полимера, на который прививают аллиламин, используют полиэтилен, полипропилен, полистирол, полимеры диенового ряда, сложные полиэфиры и т. п. Суммарная доза облучения при проведении привитой сополимеризации равна 2 10 - 5 10 рад. Гомополимер отмывают от привитого сополимера 5 - 50%-ным водным раствором неорганической кислоты, например соляной, серной, фосфорной ит.п.Иммобилизацию фермента на обработанном глутаровом альдегидом привитом сополимере проводят путем инкубации обработанного привитого сополимера в растворе фермента при физиологических значениях рН и температуре 0 - 50 С. Температура реакции привитой радиационной полимеризации не играет существенной роли, так как степень прививкие аллиламина опрсдсляется дозой облучения и количеством фосфорной кислоты.Температурный интервал определяется свойствами используемых мономеров и полимеров. Предпочтительно, полимерный носитель должен быть твердым, чтобы сохранять форму, а раствор фосфорной кислоты и аллиламина должен быть жидким, чтобы существовала возможность диффузии мономера к поверхности полимера, Поскольку для иммобилизации фермента достаточно иметь на поверхности полимера прпвп 10 15 20 25 30 35 40 40 50 55 60 65 той компонент с минимальной степенью полимеризации, то доза облучения не имеет существенного значения. Обычно это доза порядка 0,2 10 рад. Однако для увеличения гидрофильности поверхности носителя, без разрушения полимера под действием излучения, можно использовать дозы порядка 5 10 рад. Соотношение полимер: : аллиламин: фосфорная кислота также несущественно, так как привитая сополимеризация происходит с поверхности и определяющим будет не вес полимера-носителя, а его форма (пленка, порошок, изделие и т. п.) .П р и м с р 1. В ампулу помещают полипропиленовую пленку толщиной 0,1 мм и площадью 20 см, 5 г алиламина и 50 г 70%-ной фосфорной кислоты. Ампулу вакуумируют до 10 з мм рт. ст., запаивают и облучают у-лучами Со" дозой 0,5 10 рад при температуре 40 С в течение 30 мин, Гомополимер отмывают от привитого сополимера 50%-ной фосфорной кислотой и водой. Пленку промывают бикарбонатным буфером при рН 8,0 и помещают в 10%-ный раствор глутарового альдегида на 3 - 4 ч при температуре 20 С. Затем пленку промывают бикарбонатным буфером и помещают в раствор 5 мг трипсина в 10 мл бикарбонатного буфера (рН 8,0) на 10 ч прп температуре 4 С. Удельная активность иммобилизованного трипсина составляет 43% от активности нативного фермента (субстрат - 1%-ный раствор казеина).П р и м е р 2. Иммобилизацию а-хпмотрипсина проводят так же, как в примерс 1. Удельная активность иммобилизованного фермента составляет 50% от активности нативного фермента.П р и м с р 3. В ампулу помещают 3 г порошка полиэтилена, 5 г аллиламина и 70 г 40%-ной фосфорной кислоты. Привитую сополимеризацию проводят так жс, как в примере 1. Иммобилизацию трипсина проводят так же, как в примере 1, используя 5%-ный раствор глутарового альдегида. Удельная активность им мобилизованного фермента составляет 37% от активности нативного фермента.П р и м с р ы 4 - б. В 3 ампулы помещают по 5 г порошка полистирола, 10 г аллиламина и 100 г 80%-ной фосфорной кислоты. Привитую сополимсризацию и иммобилизацию трипсина проводят так же, как в примере 1, облучая ампулу у-лучами Со" дозой 0,5 10, 1 10 и 2 10 рад соответственно в течение0,5; 1 и 2 ч. Удельная активность иммобилизованных ферментов составляет 37, 29 и 48%от активности натив- ного фермента соответственно,П р и м е р 7, В ампулу помещают полипропиленовую пленку толщиной 0,1 мм и площадью 35 см, б г аллиламина и 130 г 80%-ной фосфорной кислоты. Ампулу вакуумируют до 10" мм рт. ст., запапвают и654620 Формул а изобретения Составитель Г. Коннова Техред Н. Строганова Редактор В, Минасбекова Корректор Л, Орлова Заказ 187/8 Изд,225 Тираж 520 Подписное 11 ПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, МосквагК, Раугпская наб., д. 45 Типография, пр. Сапунова, 2 облучают у-лучами Со" дозой 5 10 рад при температуре 0 С в течение 5 и. Гомо- полимер отмывают от привитого сополимера 50/о-ным раствором фосфорной кислоты и водой. Пленку промывают бикарбонат ным буфером (рН 8,70) и помещают в 25%-ный раствор глутарового альдсгида на 2 ч при 0 С, Иммобилизацию трипсина проводят так же, как в примере 1, приОС. Удельная активность иммобилизованного 10 трипсина составляет 52% активности нативного фермента.П р и м е р 8. В ампулу помещают 5 г порошка полистирола, 5 г аллиламина и 1,7 г 50%-ной фосфорной кислоты. Привитую 15 сополимеризацию проводят при 100 С, облучая вакуумированную до 10мм рт, ст. ампулу у-лучами Сов дозой 0,2 10 рад в течение 12 ч. Гополимер отмывают от привитого сополимера 50%-ной фосфорной кис лотой и водой. Порошок промывают бикарбонатным буфером (рН 7,5) и помещают в 2/о-ный раствор глутарового альдегида на 24 ч при 40 С. Затем порошок промывают бикарбонатным буфером и по мещают в раствор 5 мг фермента, выделенного из Ас 11 погпусез зр 11 егоЫез шт. 1, в 5 мл бикарбонатного буфера (рН 7,5) на 30 мин при 50 С, Удельная активность иммобилизованного фермента составляет 24% 30 от активности нативного фермента.Таким образом, из рассмотренных примеров видно, что предлагаемый способ получения иммобилизованных ферментов позволяет значительно упростить процесс иммобилизации, расширить круг полимерных носителей и получать иммобизилованныс ферменты, обладающие достаточно высокой удсльной активностью, Так, если процесс иммобилизации трипсина привитой сополимсризации на полипропилен и-нитростирола с последующим восстановлением нитрогрупп в аминогруппь 1 и обработкой аминосодерхкашего полимера активатором и раствором фермента занимает более 4 сугок и приводит к получению иммобилизованного трипсина, сохраняющего только 10/, активного натпвного фермента, то использование предлагаемого способа позволяет в течснпе 15 - 24 ч получать иммобилизованныс на различных синтетических полимерах ферменты, в том числе и трппспн, сохраняющие около 50% активности. 1. Способ получения пммобилизованных фсрментов путем привитой сополпмеризации полимерного носителя с мономером под действием ионизирующего излучения с последующей обработкой полученного при этом привитого сополимера активатором и раствором фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения активности целевого продукта, в качестве мономера используют аллиламин и привитую сополимеризацию проводят в присутствии фосфорной кислоты,2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют аллиламин и фосфорную кислоту в мольном отношении 1: : 1,0 - 10,3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве активатора используют глутаровый альдегид.Источники информации,принятые во внимание прп экспертизе 1. Иммобплпзованные ферменты. Т. 1. МГУ, 1976, с. 79 - 140.2. М. Л. 1 лИу, .1. 1 Сгагпе 11, Й. Я. Кепуоп. Иммобплизацпя трппсина на привитом сополимере полипропилена, полученном под действием радмации. Э, Ро 1 шп. Яс 1, 5 уптроз, 1975, Мо 49, 109 - 116 (прототип).