Способ получения иммобилизованных ферментов

Ъ.ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 290977 (21) 2527891/23-04с присоединением заявки Мо(51)М. Кл.С 07 6)7/02 ф Ъ 61 К 37/48 (53) УДК 577.15.88 8) осударственный комитет СССР но делам изобретений и открытий.07 (О 2) Авторыизобретения таллинский политехнический институт Заяви) СПОСОБ ЭОцУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ 2Ьктивированными бифункциональным реагентом - 1,4-бензохиноном 2). Согласно известному способу иммобили- зованные ферменты (например, трипоин, пенициллинамидаза) или другие протеи- ны получают путем ковалентного связывания их с полисахаридными носителями при помощи 1,4-бензохинона или 1,2-нафгохинона, Гели (например, АП"берекетове 4 В) подвергают инкубации при перемешивании в фосфатном буфере (рН 7,4) в присутствии 1,4-беизохииона при комнатной температуре в течение 20 ч. После удаления иепро- реагировавшего бенэохинона промыванием геля добавляют фермент и прово" дят реакцию при 2 фС в течение 24 ч. Иммобилизованный фермент промывают многократно буфером, а затем 1 М раствором хлористого натрия. Отмечается, что активность препарата сохраняется при температуре 4 С в течение 3 месяцевЭтот способ прост. Однако в этой способе неустраняется,указанный недостаток, присущий другим известным способам иммобилизации, а именно ниэ" кая термостабильность получаемых препаратов.Ъ Изобретение относится к областй биотехнологии и, в частности, к спо-собу получения иммобилизованных фер" ментов, которые сохраняют общие свойства ферментов и могут быть использованы в качестве гетерогенных катализаторов в реакциях превращения органических соединений и биохимических препаратов как в периодическом, О так и непрерывном процессе катализа, в химической, микробиологической, медицинской и пищевой промышленйости,Известные в настоящее время спо-собы получения иммобилиэованных фер 15 ментов методами ковалентного связывания ферментного белка на водоне" растворимЫе носители основываются на применении бифункциональных реагентов, которые способны реагировать с водонераствоуимым носителем и с ферментным белком 1. Общим недостатком большинства известных способов можно считать относительно низкую термическую стабильность получаемых препаратов.Известен также способ получения иммобилиэованных ферментов посредством ковалентного связывания ферментов с водонерастворимыми носителями,А.Я. Озолиньш, М.О. Мандель, К,Э. Эаппель й А.И. КестнерЦелью иэобретения является увеличение термостабильности препаратовиммобилиэованных Ферментов.Указанная цель достигается эа счеттого, что иммобилиэованные Ферментыдополнительно обрабатывают глутаровым альдегидом в количестве 0,5 -3 ьщэкв . на 1 г носителя при 4-40 Сэ течение 1-24 ч.Согласно изобретению описываетсяспособ получения иммобилизованныхферментов с повышенной стабильностьюарепаратов путем ковалентного связывания Ферментов с водонерастворимыминосителями, предварительно активированными 1,4-бенэохиноном, с последующей обработкой препаратов глутаровымальдегидом в количестве 0,5-3 мл экв,на 2 г носителя при 4-40 ОС в течение-24 ч.Реакция связывания Фермента с 1,4-бензохиноном осуществляется через 20аминогруппы белка и носителя. С цельюувеличения количества аминогрупп найосйтепе его можно предварительно обрабатывать 3-аминопропилтриэтоксйСиланом. После нуклеофильного присоеди- днения 1,4-бенэохинона носителем иФерментным белком на поверхности ноОителя образуется оболочка иэ ферментного белка, которая вследствие диссоциации легко удаляется и тем самымуменьшает стабильность иммобилиэованного Фермента.После реакции свободных остатковаминогрупп а такой оболочкой образуются.прочные дополнительные связиМежду отдельными молекулами Ферментного белка и глутарового альдегида,Таким образом, образуется препаратиммобилизованного Фермента, которыйобладает более высокой термическойстабилЬностью. Следовательно, соче Отаяне двух самостоятельно протекйо-щих реакций в прйсутствии реакциойноспособных бифункциональных реагентовприводит к повышению доли стабильнойФракции иммобилизованного Ферментав препарате от 30 до 55, а скоростьтермической йнактивации стабильнойфракции Фермента уменьшается в 4 раза при температуре 70 С,П р и м е р 1. Взвешивают 10 гсиланизированного 3-аминопропилтриэтоксиланом силохрома СХс разме рами частиц 0,25-0,5 мм и содержанием активных аминогрупп на поверхностй носителя 190 мл экв/г. Добавлян 1 т 1,5 г кристаллического 1,4-бенэохинона и 40 мп технического этанола. После контактирования суспензиив течение 1 ч при комнатной температуре полученный продукт промывают техническим этанолом до полного исчезновения темно-коричневого цвета в промывных водах (всего 500 мл/г), а затем дистиллированной водой (всего200 мп/г) для удаления следов этанола. Получают 22,3 г влажного материала.Для проведения иммобилизации пенициллинамидазы 10 г материала смешивают с 50 мл Ферментного раствора с пенициллинамидаэной активностью 20000 Е/мл. За единицу де)ствия пенициллинамидазы принято такое ее количество, которое гидролизует К-соль бенэилпенициллина в 17 мл раствора при 40 С и рН 7,0 в присутствии 0,1 М КС с образованием одного мкмоль Фенилуксусной кислоты в 1 ч. После инкубации смеси при комнатной температуре в течение 10 ч готовый материал промывали сначала дистиллированной водой (всего 1000 мл), а затем 1 М растэором БаС 3 для удаления непрореагировавшего фермента.Получают 9,9 г иммобилизованной пенициллинамидазы, которая обладает активностью 5200 Е/г сухого препарата.Дпя увеличения стабильности полученного препарата его обрабатывают при помощи водного раствора глутарового апьдегида: на 8,5 г иммобилиэованной пенициллинамидазы добавляют 90 мл 0,1 М фосфатного буФера рН 7,0 и 10 мл 25-ного раствора глутарового альдегида (1,5 мл.экв. на 1 г влажного материала). Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. После обработки препарат промывают для удаления следов глутарового альдегида дистиллированной водой (всего 500 мл).Для определения стабильности препарата инкубируют его при температуре 40 С в 0,1 М фосфатном буферео(рН 7,5), в течение 800-1000 ч. Скорость термической инактивации иммобилиэованной пенициллинамидазы равняется 0.,000333 ч.Сравнительные данные по стабильности препаратов пенициллинамидазы, обработанной глутаровым альдегндом н беэ него, приведены в табл. 1,744002 Таблица 1Стабильность препаратов иммобилизованнойпенициллинамидазы, полученной ковалентнымсвязыванием Фермента 1,2-бенэохинономи обработанных глутаровым альдегидоми беэ него Исходя18,5 5200 5060 0 0 3 85 4 80,4 312 678 31 р 4207 3692 3297 3266 4 263 5 401 9,3 0 4 63,4 62,8 7 б 592 5 133 35 мл 25"нодегида на дистилли- одолжаетпрепарат уфером е 2 0 3%Таким образом, применение глута- примере 1. Приюеняют 0,24рового альдегида приводит к увеличе го раствора глутарового альнию работоспособности иммобилиэован- . 1 г сухого носителя,в 10 млной пенициллинамидазы (активность не рованной воды, Обработка прниже 3000 Е/г) не меньще, чем в 3 - ;ся в течение 2,5 ч. Готовый4 раза. ;промывают 0,1 МацетатнЫм бП р и м е р 2. Получение активи- Зо ,РН 45рованного носителя осуществляют также, как описано в примере 1, С целью .Термостабильность иммобилиэованполучения препарата с Р-галактозидаэ- ной Р-галактоэидаэы изучают инкубиной активностью составляют смесь из . рованием препарата в 5-ном растворефермента и носителя (5 мл ферментно- лактозы (рН 4,5) при температурего раствора активностью 48 е/мл на З 5. 70 ОС в течение 180 мин, установл но,1 г носителя), После инкубации в те- что препарат ийактивируется в две "чение 5 ч при комнатной температуре стадии: за первой стадией (тн.негранулы промывают 0,1 М ацетатным стабильная фракция фермента, всебуфером рН 4,5 и 1 М раствором Вам, го 42), следует втора 1 я стадия сПолучают препарат с активностьюфо ,фстабильной фракциейфермента201,8 Е/г сухого материала.. . (58). Скорость инактивации стаЗа единицу действия Р-галактоэида- бильной Фракции 1 ф фермента 0,0095 мийзы принято такое ее количество, кото- П р и м е р ы 3- б. Эти примерыРое осуществляет гидролиэ синтетичес- описывают обработку глутаровым алького субстрата О-нитрофенил-)3-0-га дегидом препаратов иммобилизованнойлактопиранозида при температуре 30 С пенициллинамидазы в различных услов 0,1 М ацетатном буфере РН 4,2 с , виях,образованием мкмоль О-нитрофенола в . Условия проведения обработки итечение 1 мин. Обработку глутаровцмрезультаты по стабильности препаратовальдегьщом проводят, как описано в 50 приведены в табл. 2.Т а б л и ц аУсловия проведения обработки иммобилизов аннойпенициллинамидазы глутаровым альдегидоми стабильность полученных препаратов744002 т/ Продолжение табл .2 2,25 1,0 22 1,24 1,035 0,94 24 4 1,8, 0,99 0,75 3,0 650 б ф 2 2 о тШательного перемешивания) оставляютв холодильнике. Реакция носителя сферментом продолжается 17,5 ч,фильт -рацией удаляют 48 мл ферментногораствора с активностью 3120 Е/мл(всего 149760 Е, 19,4). Препарат иммо.билизованной инвертазы промывают ацетатным буфером (т.е. удаляют еце81000 Е, 10,5) и дополнительно 1 Мраствором КС 8 (т,е. удаляют еще18800 Е, 2,2) . Активность препаратаиммобилизованной инвертазы - 4500 Е/гвлажного носителя (всего 225000 Е,29,2)Для увеличения стабильности полученного препарата его обрабатываютпри помоши водного раствора глутарового альдегида: на 50 г иммобилизованной инвертазы добавляют 480 мл0,05 М ацетатного буфера рН 4,7 и20 мл 25-ного раствора глутарового 4 О. альдегида (0,5 мл экв. на 1 г влажного материала) . Смесь выдерживаютпри комйатной температуре в течени1 ч. После обработки препарат провают для удаления следов глутарового 45 альдегида 0,05 М ацетатным буфером.Активность полученного препарата4430 Е/г (всего 221500 Е, 28,8) .Для проверки работоспособностиданного препарата 49,8 г гранул им-,мобилизованной инвертазы помещают втерморегулируемую при 50 С колонку,а через нее пропускают раствор сахарозы с концентрацией 700 мг/мл соскоростью 14 мл/мин. Содержание реду цирукицих сахаров в продукте 690 мг/мл,степень конверсии 98,6. ают активироноситель слее мыСравнительные да бильности препарато инвертазы, обработа альдегидом и без не табл, 3. ые по термостаиммобилизованно ой глутаровымприведены в Стабильность определяюв 0,1 М фосфатном буфере 40 С,П р им е р 7. Получванный 1,4-бензохинономдуюшим образом.Взвешивают 10 г силохрома СХс размерами частиц 0,25-0,5 мм,добавляют 20 мл дистиллированной воды и 1,0 мл 3-аминопропилтризтоксисилана (содержание аминогрупп в силане 3800 мк зкв/мл) перемешивают и оставляют при комнатной температуре. Чераэ 3 ч гранулы фильтруют и нагревают при температуре 120 С в течение 1 ч. Рранулы промывают многократно (5 раз по 300 мл дистиллированной водой) до исчезновения в промывных водах следов силана (обнаруживают хиноном). Содержание активных аминогрупп на поверхности носителя 180 мк экв/гсухого материала.на 10 г обработанного силаном силохрома добавляют 1,5 г кристаллического ),4-бензохинона и 40 мл технического зтанола, После контактирования суспензии в течение 1 ч при ком натной температуре полученный темно- коричневый продукт промывают техническим этанолом, дистиллированной водой и О;05 М ацетатным буфером рН 4,7.Дпя получения иммобилизованной иввертазы применяют дрожжевую инвертазу марки А Олайнеского завода химреактивов. 7,5 г порошка инверта 5 зы растворяют в 50 мл 0,05 М ацетатного буфера РН 4,7, активность 15400 Е/мл (всего 770000 Е). Активность инвертазы выражают в микромолях сахаровы,которая расшепляется при действии фермента в 7-ном растворе сахарозы в 0,05 М ацетатном буфере РН 4,7 при температуре 40 С, 50 мл раствора инвертазы приливают к 50 г гранул влажного активированного силохрома. Полученную суспензию (после осле инкубации препаратапри рН 7,5 и температу744002 Таблица 3 Стабильность препйратов иммобилизованйой инвертаэы, полученной ковалентным. связыванием фермента с 1,4- -бензохнноном и обработанной глутаровым альдегидом и без него (стабильность определяют хранениеМ препаратов при 60 С в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7) 1 Исходная 2 10 3 20 00 450 4 0 8 96,3 93,7 4266,1 4150,9 б 8 4 4 5 6 69,3 62,3 2 118,5 803,5 99,7 33,2 28,2 0 б 80 7 100 53 2 3 6 8,46., 8 07 116,0 4 время полужизни иммобилизованной 30инвертазы равняется для препарата,обработанного глутаровым альдегидоми без него, 160 и 86 мин соответственноСкорость термоинактивации препарата увеличивается до 2,раз; 35П р н м е р 8. Получение активированного носителя для иммобилизацииглюкоамилазы осуществляют так же, какописано в йрймере 7. В работе применяют глюкоамилаэу Фйрмы Ново (Да О : . ния) из Азр. п 1 дег. активностью ,500 Е/мл и с содержанием белка300 мг/мл. Активность Фермента выражается о способности образовыватьиэ 0,5-ного растворимого крахмала ,цв течение 1 мин при температуре 20 С и рН 4,7 (0,05 М ацетатный буфер) :1 мкмоль глюкОэы. Концентрацию белка определяют по поглощению ферментного раствора при 280 нм. 50На 11,0 г активированного силаном и 1,4-бензохиноном силохрома добав ляют 25 мп ферментного раствора глюкоамилазы с активностью 500 Е/мп (нСего 12500,Е) и контактируют суспензию 55 в течение 114 ч при комнатной тЕмпера- туре, Маточюй раствор содержит после реакции белка 117,5 мг/мл (всего 2938, мг, 39,2) и имеет активность 480 .Е/мл (всего 12000 Й, 96). Препа-.6 О рат иммобилизованной глюкоамилазы имеет активность по 0,5 крахмалу3093 Е/г влажного препарата. для увеличения стабильности полученного препарата его обрабатывают при помощи водного раствора глутарового альдегида: на 11,.0 г иммобилизованной глюкоамилазы добавЛяЮт 91 вР 2 0,05 М ацетатного буфера рН 4,7 и 8,6 мп 25-ного раствора глутарового альдегида (1,0 мп"Экв. на 1 г влажного матеРиала). Смесь выдерживают при комнатной температуре "в течение 3 ч. После обработки препарат провевают 0,05 М ацетатным буФером для удаления следов глутарового альдегида."сАктивностьполучейного препарата 30,2 Е/г.Для проверки работоспособности иммобилизованной глюкоамилазы 10,94 г препарата помещают в термостатируемый реактор с перемешиванием и добавляют 35-ный раствор мальтодекстрина (ФирмаИайзенфф, исходныйдекстроэный эквивалент 17,5) в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7, Гидролиз мальтодекстрина проводят при температуре 60 С. После 10 мин гидролиза содержаниередуцирующих сахаров (опреде" ляемых по Бернфельду динитросалици" лозой кислотой) 50 мг/мл, через 40 мин - 240 мг/мл, 120 мин -280 мг/мл.Сравнительные данные по термоста" бильности препарата иммобилизованной Глюкоамилазы, обработанной глутаро вым альдегидом и без него, приведены в табл. 4,744002 Таблица 4 Стабильность препаратов иммобнлиэованной глюкоамнлазы, полученной ковалентным связыванием фермента с 1,4- -бензохиноном и обработанной глутаровьщ альдегидом и беэ него (стабильность определяли хранением преларатов при 60 С и в 0,05 М ацета 1 ном буфере рН 4,7) 500 100 30,3 1 Исходные 0 1020 441 88,2 76,3 30,3 0 0,2 1 60,4 0 84,7 28,6 6 255,5 51,1 255,5 51,1 5 4 8 26,1 23,9 23,3 6 00 20 9 6ие 0 21,2 7 0 9 79 17 34,6 21,0 32,5 20 ю 7 77,0 76,3 12 2 7 Составитель А. БочаровРедактор Г. Никольская Техред,О. Андрейко Корректор екм Заказ 3642/1 Подписноекомитета СССРоткрытийскан наб., д,Тираж 495 ЦНИИПИ Государственного по делай изобретений 13035,Москва, Ж, Раилиал ППП фПатент, г,. Ужгород, ул, Проектная, 4 Таким образом, активность препара- л и ч а .ю щ и й с я "гем, что, ста, обработанного глутаровым альдеги- - целью увеличения термостабильности"дОМ, йадает до 76% в течаййе 180 Мин, целевых продуктов, иммобилизованныев то время как актйвность препарата ФеРментыдополнительно обрабатываютбеэ обработкй глутаровым алщегидоМ . " глутаровым альдегидом в количествесиижается до 76% уже в течение" 90 мин,4 0,5-3 мл экв. на 1 г носителя прит.е. в, 2 раза быстрбе. : , .: :. 4-40 фС в течение 1-24 ч.Источники информации,Форйула изобретения:, .принятые во вниманйе при экспертизе