Способ получения метиониназы

Березов (СССР), Сода Кении, Есаки Нобу Шугие Кунио (Япония)-1 л 1,и;,Я,А н тет дружбы йародов) Заявитель атри му Щв ЦО,(5 Й) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЕТИОНИНАЗ 2 1Изобретение относится к биохимии, а именно к методам выделения и очист"ки Ферментов из микроорганизмов, и может быть использовано в энзимологии.Известен способ выделения метиониназы 2-метионин"у-лиазы из культуры , С 1 ойг 1 д 1 Ощ зрогооепез, включающий весть стадий очистки Фермента (1Недостаток данного способа - не - :1 О большой выход Фермента и незначительная степень очистки.Известен также способ полученияметиониназы из. культуры Рзеодоаопаз оча 11 з, включающий получение грубого экстракта, хроматографию.на ДЭАЗ-целлюлозе с элюцией 0,05 И Фосфатнымбу фером, содержащим пиридоксальфосфат и меркаптоэтанол, осаждение 20-50 сульфатом аммония, вторичную хрома- ро тографию на.,ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буферным раствором, осаждение503 сульфатом аммония, тепловую об- -. работку, хроматографию на гидроксилаппатите, хроматографию на ДЭАЗ-сефадексе с элюцией 0,02 И калий,фосфат" ным буфером, с добавлением 0,1 И хлористого калия и хроматографию на сефадексе 6-200. Конечный выход ме"тиониназы 7 Ф2 3Однако известный способ не приводит к получению фермента с высокой удельной активностью. Кроме того, способ сложен, так как включает большое число операций.Целью изобретения является повышение степени очистки и активности Фермента, .а также ускорение способа получения метиониназы.Поставленная цель достигается тем, что, при осуществлении способа получения Фермента путем экстракции куль". туры Рзеидовопаз рц 11 да с последующим. выделением целевого продукта хроматографией экстракта на ДЭфЗ-целлюлозе, хроматографией на.ДЭАЗ"сефадексе и гельфильтрацией элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе осу"3 99455ществляют пиридоксальфосфатным бу"фером с градиентом хлористого калияот 0,12 до 0,18 М, а элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе проводят пиридоксальфосфатным буфером сградиентом хлористого калия от 0,2до 0,4 М, а очистку целевого продукта дополнительно проводят хроматографией на колонке с ДЗАЭ-целлюлозой.Способ осуществляют следующим об"разом.Полученный бесклеточный экстратпосле разрушения микроорганизмов под".вергают хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и после элюзии из колонки линейным градиентом хлористого калияот 0,12 до 0,18 М активные фракции,после диализа в течение 16 ч, вновьподвергают хроматографии на колонкес ДЭАЭ-сефадексом (А), ферментэлюируют градиентом хлористого калияот 0,2 до 0,4 М,При концентрации хлористого калияменее 0,2 М не происходит элюирование фермента, но элюируются другиебалластные белки. В собранных фракциях определяют активность метиониназы. Активность была сосредоточенав пробах от Ю 45 до Н 80. Эти пробыобъединяют и диализируют против пиридоксельфосфатного буфераАктивные фракции подвергают вторичной хроматографии на колонке сДЭАЭ-целлюлозой. Элюзию проводят линейным градиентом хлористого калияот 0,12 до 0,18 М. На заключительномэтапе обессоливают целевой. продуктметодом гель-хроматографии, используя гель Тойоперл НУили Сефадексытипа 0-25, С, С.П р и м е р. Культуру Рзецсояопаь40рцэрда Г 03738 выращивают на средеследующего состава, Ф: 2-метионин0,25; мочевина 0,1; глицерин 0,1;КН 2 РО 0,1, К 2 НРО О,11 М 9504. 7 Н 200,01; дрожжевой экстракт 0,025, Куль- фтуру выращивают при 28 18 ч с аэрацией. Клетки отмывают дважды раствором 0,853-ного МаСВ, а затем 0,01 МФосфатным буфером (рЬ 7,2), содержащим 10 ф М и пиридоксаль-фосфати 0,013 2-меркаптоэтанол. Клетки(150 г) разрушают и суспендируют втом же буферном растворе,Супернатант диализируют в течение 21 ч против вышеуказанного буфера. Образующийся осадок удаляютцентрирфугированием. Полученный грубый экстракт объемом 2500 мл с удель" ной активностью 0,07 нмоль наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой.Элюирование .фермента проводят КСР (0,12 М) в течение суток, затем постепенно заменяют на более концентрированный раствор КСР (0,18 М).Элюируют калийфосфатным буфером 0,1 М (рЬ 7,2), содержащего 2.10- М пиридоксальфосфата 0,01 меркаптоэтанола и 0,0 М этилендиаминтетраацетата (ЭДТА).Первый раствор элюирует балластные белки, а второй - фермент метиониназу. Диализ проводят против пирофосфатного буфера.После диализа раствор Фермента переносят на колонку с ДЭАЗ-сефадексом (А). Сначала элюируют балластные белки пирофосфатным буферомв присутствии О, 1 М КО (1 л). Затем увеличивают концентрацию КСР до0,2 М и подключают коллектор фракции, Активность фермента определяют в пробах, а затем подключают градиентную элюцию раствором пирофосфатного буфера с возрастающими концентрациями КСР (от 0,20 до 0,40 М). 8 собранных фракциях (по 13 мл) определяют активность метиониназы, Ферментная активность была сосредоточена в пробах от У 45 до Ф 80.Объединенные пробы с У 45 до У 80 (общий объем 550 мл), После диализа переносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Колонку промывают 500 мл калийфосфатного буфера, содержащего пиридоксальфосфат и меркаптоэтанол, ноне содержащего ЭДТА. Затем колонкупромывают последовательно 0,07 М(500 мл) КСР и 0,12 М (500 мл) КС 6 .Элюирование проводят градиентнойэлюцией с 0,12 М по 0,18 М КСР (600 мл), собирая пробы по 6 мл в каждой пробирке. Во всех пробах определяют активность метиониназы. Наибольшая активность фермента была сосредоточена в пробах с И 50 по В зависимости от активности фермента пробы объединяют в 3 объема,в каждом из которых определяют общую активность фермента. Из каждогообъема берут пробы для диск-электрофореза,Все три объема подвергают гельфильтрации через колонку с Тойоперл(НИ). Злюирование проводят калийфосфатным буфером (рЬ 7,2), и актив5 994554 6ные фракции, содержащие целевой про- в минуту), выСокой степенью очисткидукт, объединяют. и за меньшее число операций,Предложенный способ позволяет по- В таблице приведены сравнмтель"лучать фермент с высокой удельной ные данные сопоставительногО анализаактивностью (19,1 мкмоль/кг белка з предложенного и известного способов,Общаяактивность,мкмоль/мин Удельнаяактивность,мкмоль/кгбелка/мин Выход,Степень очистки Способ 274,3 Предлагаемый 329,2 19 10 10,1 Известный Й 10 1.,810 Формула изобретения Составитель А. ДонцевРедактор М. Дылын Техред С,Мигунова Корректор Н. Король,Заказ 565/7 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Способ получения метиониназы путем экстракции культуры Р 5 ецдовопаз ройЬа с последующим выделением целевого продукта хроматографией экстракта на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе и гельфильтра,цией, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа, повышения активности и степени очистки фермента, элюцию при хроматографии на ДЗАЗ-целлюлозе осуществляют пиридоксальфосфатным буфером с градиен-, том хлористого калия от 0,12 до О, 18 М, а элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе. проводят пиридоксальфосфатным буфером с градиентомго хлористого калия от 0,2 до 0,4 И,а очистку целевого продукта дополнительно проводят хроматографией наколонке с ДЗАЗ-целлюлозой.Источники информаций,г 5 принятые во внимание при экспертизе1. Кгев У.,Незво С. Во 1 о 9 са 1ЕНесйз о епгуваСс Ьергчайоп оп.-вейноппе и се 11 со 1 йцге опехрегвепйа 1 йцвог. Сапсег Йев. 33,3 О 1866-1869 19792. Тапаса Н., Ева 1 с М;, тававбйо Т., ЗоЬа К РцгГсайоп апЬ ргорегйев оГ МейЬоппаве 1 гов РвецЬовопаз оча 1 з. РЕВА .еййегз, бб, 307311, 1976.