Способ конструирования штаммов еsснеriснiа coli-продуцентов рестриктазы и метилазы е со r

72) Авторы изобретен Косых, Я. ИБурьянов и А 7 ) Заввител Институт биохимии и фиАН СССР гии роорганизмо(54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ШТАММОВЕЯСНЕИСН 1 А С 01 Д - ПРОДУОЕНТОВ РЕСТРИКТАЗЫИ МЕТИЛАЗЫ Е со В, И повыше соде ативн1содержит в себекэо- и эндонук",ирующие метилаэы.ии - модификациик разряду эндо Микробная клетк гочисленные какзы, так и модиф Ферменты рестри о К 11 относятс леаз и метилаз. Известен способ ммов-продуценто лючЪющийся в том.нук конструирования таких ферментов, что плаэмиду с геИзоБретение относится к микробио-.логической промышленности и представ." ляет собой способ конструирования штаммов 8 сЬег 1 СЫа со 11, несущих плазмиду с генами рестриктааы и метилазы ЕсоКП.Известны высокоспецифические рестрикционные эндонуклеазы и модицируют щие метилазы, которые широко используются для физического картирования хромосом, определения первичной структуры ДИК, выделения генов, а также в экспериментах по генетическому конст,руированию 3 п чзйго.амно э:лев иц нами рестриктазы и П путем коньюгации иЕясЬт 1 сЫа со 1 Ьлучают штаммы продЕ со К П 1 Д.Однако полученные таким образом штаммы содержат интерферирующие ферментативные примеси. Поэтому обнаружение и выделение ферментов Е со Й П на фоне других внутриклеточных интер" Ферирующих Ферментативных активностей весьма затруднено.Цель изобретения- ние штаммов - продуцентов, не ржащих интерферирующих Фермент ых прюесей.Для достижения цели используют затаим ЕясЬегЫпа со 1. В 834 качестве плазмиды используют ду М 3 или й 245.Втамм Е. со 11 В 834 (г, пВ) не содержит ни рестрикционной эндонук.- леазы Е со В, ни модифицирующей метиааэы Е со В, ни ДНК-цитозин-метилаэы,3 94142характерной для штамма Е. со 11 НВ 11001 21.По предлагаемому способу были получены 2 штамма.Штамм ЕзсйегсЫа со 11 В 834 (г, з , а 1) /й 245 характеризуется следующймй признаками,Морфологические признаки. Клеткипрямые палочковидной формы (1,115) к (2,0 " 6,0) мк, подвижные с 10перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.,Куль тура ль ные и риз на к и. Хорошо растутна простых питательных средах. Приросте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре "Дифко", минимальномагаре Девиса с глюкозой и казаминовыми кислотами колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, крайровный, мутные (на синтетических средах - более слизистые и мутные) . Приросте в жидких средах: мясо-пептонном бульоне, бульоне Дифко",.минимальной М 9 с глюкозой и казаминовыми кислотами образуют ровную, интен з сивную муть. физиолого-биохимические признаки.Растет в йределах 4-45 С при оптимумрН 6,8-7,5В качестве источника углерода используют многие углероды, спирты, органические кислоты, в частности Й-глюкозу, Й-фруктозу, сахарозу, арабинозу,ксилозу, лактозу, трогалозу. Не усваивает ацетат, аданит, галактозу, Всредах с глюкозой активно пьдкисляетс образованием газа.В качестве источника азота используют как минеральные, соли в аммонийной и нитратной форме, так в органи- фОческой форме в виде пептона, аминокислот, Нитраты восстанавливает донитритов. Белатину не разжижает,Уреазйая активность не обнаруживается,. Ийдол не образуетУстойчивость к антибиотикам. Проявляет устойчивость к тетрациклину(30 мкг/мл) .Штамм Еясйег 1 сЫа со 11.В 834 (г,а )/И 3 характеризуется теми же морфо ЯВлогическими, культуральными и Физиологоб иохим ическими и риз на ками,Устойчивость к антибиотикам. Проявляет устойчивость и стрептомицину:тонногобульона вносят 1 мл культуры 3 фЕ. со 11 В 834 и выращивают до плотности 0,4 (ФЭК, светофильтр 6, кювета0,5 см). После охлаждения клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 10 мИ ИаС 1,После 20-минутной инкубации во льдуклеткисобирают центрифугированием иресуспендируют в 1/2 объема 75 мИСаС 8 . Клети инкубируют 20 мин ивновь собирают центрифугированием.Осадок ресуспендируют в 1 мл 75 мМСа СРя,К 0,2 мл суспензии полученных клеток добавляют 0,1 мл ДНК плазмидый 245, инкубируют во льду 20 мин,Затем смесь подвергают 2- минутнойобработке при 42 С и выдерживают15 мин при 24 С, Смесь разбавляют в10 раз бульоном, подращивают клетки30 мин при 37 ОС, отбирают на 0,1 млсуспензии и высевают на чашки с питательным агаром, содержащие 30 мкг/млтетрациклина. Выросшие клеткиЕ, со 1 хВ 834 (г-, ш )/й 245 растят до позд",еней логарифмйческой фазы в питательном бульоне "Дифко". Клетки собираютцентрифугированием 6000 д, до 20 мини ресуспендируют в буфере следующегосостава: 0,01 м К-РО, рН 7,01 мМЭДТА, 7 мИ 2-меркаптоэтанол, 5 Ж глицерин, Клетки разрушают ультразвуком.После разрушения центрифугируют100000 ц, 1 ч при 4 С. Бесклеточный(гв, ш) и получают бесклеточныйэкстракт из сконструированного штамма Е. со 1 д В 834 (г-, щ )/И 3 аналогично описанному в примере 1.Определение активности ДНК-метилаз.Активность метилазы определяютв реакционной смеси общим объемом150 мкл, содержащей 40 мИ К-РО,рН 7,8, 1 мМ ЭДТА, 7 мИ 2-меркаптоэтанол, 20 мкг ДНК спермы лосося,4 мкМ/метилН/Я - аденозилметионина и 50 мкл бесклеточного экстракта.Реакцию проводят при 37 С в течение1 ч, добавляют равный объем 0,75 Иедкого натра, инкубируют 30 мин при60 С. Затем к пробам добавляют 2 млхолодной 5 Ф-ной трихлоруксусной кислоты, Осажденную ДНК наносят на фильтры, промывают 0,01 И НС 1 и спиртом.После просушки фильтров определяютрадиоактивность.5 9414Для определения специфичности включения метки в азотистые. основания ДНК последнюю элюируют с фильтров, гидролизуют до азотистых оснований 57/-ной хлорной кислотой и основания разделяют хроматографией на бумаге. Определяют местоположение оснований на хроматограмме в проходящем УФ-свете, вырезают "пятна", соответствующие разным основаниям и определяют 1 Ов них радиоактичность.Формула изобретенияСпособ конструирования штаммовЕзсЬег 1 сЫа со 11 - продуцентов рест.риктазы и метилазы Е со В 11 вклю 23 6чающий трансформацию плазмиды, имеют щей гены рестриктазы и метилазы Е со К и, в клетки Езспег 1 сЫа со 11 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью получения штаМмов-продуцентов, не содержащих интерферирующих ферментативных примесей, используют штамм ЕясйегЫпа со 11 В 834, а в качестве плазмиды используют плазми ду И 3 или К 245.Источники информации,принятые во внимание при экспертизеБурьянов Я. И. и др. ДАН СССР,1 977 т. 237, Ю2, с. 465-468. 2 Хоой Х, В , д. Мо 1. Бю 1 ч.6, 1966, р, 118-133,Составитель Т. ТуляковаРедактор Л, Алексеенко Техред А, Ач Ко оектор М. Пожорое оф еаПодписное Заказ 4763/9 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета ССССР по делам изобретений и открытий 110 Яд Москва Ж-Я Раушская наб. д, 4 Д филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4