Способ определения хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.ц 940062 Сфюз СфеетсникСоциалистнесивРеснубееДата опублнкаваня описания 03.07.82 Ю, М. Лопухин, Ю, А. Владимиров, М. Н. Молоденков; Г. И. Клебанов, В. И. Сергиенко и М. П. Шерстнев(72) Авторы зобретения 2-ой Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЕЯИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПЛАЗМЫ И СЫВОРОТКИ КРОВИ1Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики различных заболеваний.Известен способ определения хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови путем добавления двухвалентного железа и регистрации вспышки свечения 11 .Однако известный способ недостаточно точен вследствие наличия в образцах крови в различной степени выраженного гем опиэа еЦель изобретении - повышение точности метода путем устранения влияния гем олива еПоставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа опредеЭения хемилюминесценции плазмы и сыЬорожи крови путем добавления двухва,центного железа и регистрации вспышки Ьвечения, сыворощу или плазму крови гопре аварительн о обрабатывают растворами. вористого кальщщ и кристаллического гепарина и выделяют липопротеиды низкой плотности. 2Способ осуществляют следующим образом.Образцы плазмы и сыворотки крови предварительно обрабатывают О, 1-4,0 мл 0,05 - 0,8%-ного раствора хлористого кальция и 0,01-0,8 мл 0,1-10%-ного раствора гепарина в зависимости от вида животного с последующим выделением липопротеидов низкой плотности. П р и м е р 1. Берут сыворотку крови в количестве 0,2 мл (донор мужчина 26 лет), добавляют 2 мл 0,28%-ного раствора хлористого кальция и 0,04 мл 1%-ного раствора кристаллического геларина. Полученный раствор инкубируют в течение 4 мин, и затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Супернвтант удаляют, к осадку прибавляют 1 мл 0,85%- ного раствора хлористого натрия и помещают в кювету хемилюминесцентной установки для исследования. К полученной суспензии липопротеидов низкой плотности добавляют 8 мл 120 мМ фосфатного2 фПараметры вспьппки инициированнойдвухвалентным железом хемилюминесценции 1 мл сыворотки крови изменилисьследующим образом: 5 5,5 (,61%), Ь 9,5( 50%), соответственно хемидюминесцен-.ащ липопротеидов низкой плотности из0,2 мл сыворотки крови: 6 22 усл, ед.(114%), Н 7 усл, ед. (88%).,П р и м е р 3. Берут сыворотку кро ви беспородного кролика массой 3,4 кг.К 0,2 мл сыворотки крови кролика добалвяют 2 мл 0,28 Много раствора хлористого кальция и 0,2 мл 1%-ного раствора кристаллического гепарина, Полученный раствор инкубируют 4 мин и затемцентрифугируют 5 мин при 3000 Об/мин.Супернатант удаляют, к осадку добавляют1 мл 0,85%-ного раствора хлористогонатрия и помещают в кювету хемилюминесцентной установки, куда добавляют8 мл .20 мМ фосфатного буфера рН 7,4,К полученной суспензии липопротеидовнизкой плотности добавляют 1 мл 25 мМраствора двухвалентиого железа(Р 660 7 Н 0) - возникает вспышка хемиРпоминесценции. Оптическая плотность сыворотки крови при 440 нм составляет 0,29, Папаметры вспьппки инициированной двухвапентным железом хемилюминесцении 0,2 млсыворотки крови равны: 5 45,5 усл. ед.,6 усд, ед., 1 45 с, Н 9 усл. ед., соОтветственно хемидюминесценции липопротеидов низкой плотности из 0,2 млсыворотки крови: 5 24,5 усл, ед И 3,5усл. едт; 80 с,Н 6 усл. ед. После искуственно вызванного гипотоническогогемодиза оптическая плотность сыворотки крови увеличилась до 1,12.Параметры вспышки инишированнойдвухвалентным железом хемилюминесценции 0,2 мл сыворотки крови изменилисьследующим образом: 6 0 усл. ед., Ь 3 усл,ед, (50%),Ос, Н О, соответственнохемилюминесценция липопротеидов низкойплотности из 0,2 мл сыворотки крови:8 24 усл. ед. (98%), Ь 3 усл. ед. (86%),80 с (100%), Н 5 усл, ед. (83%),Таким образом, для регистрации хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови оптимальными условиями для человека являются 0,2 мл сыворотки крови, 2 мл 0,28%-ного раствора хлористого кальция и 0,04 мд 1% ного раствора гепарина. Для сывороткикрови кролика оптималь ными условиями экспериментально выбрано 0,2 мл сыворотки крови, 2 мл 0,28%3 94006 буфера, рН 7,4, и 1 мд 25 мМ раствора двухвалентного железа.Возникает вспьппка хемилюминесценции, Оптическая плотность при 440 нм составляет 0,28 (для исходной сыворотки крови). Параметры вспышки,инициированной двухвалентным, железом хемилюминесценции 0,2 мл сыворотки крови равны 5 42,5 усл. ед., 1 17,5 усл, ед.,25 с, Н 11 усд, едсоответственно хемилюми- е несценшщ липопротеидов низкой плотности иэ 0,2 мл сыворотки крови: Б 205,5 усл, ед., Ь 27 усл, ед.,50 с, Н 26 усл,ед, После искусственно вызванного гипотонического гемолиза оптическая плотность 15 сыворотки крови увеличилась до 2,25. Параметры вспышки инициированной двухвалентным железом хемилюнесценции 0,2 мд сыворотки изменились следующим Образом (в скобках процентное выраже- щ ние относительно исходных значений):28,5 усл. ед (67%), Ь 15,5 усл.ед. (89%),60 с (240%), Н 9 усл. ед. (82%), соответственно хемилюминесценция липопротеидов низкой плОтнОсти из 5 0,2 мл сыворотки крови: 5 119 усд. ед. (80%),24 усл. ед. (89%),40 с (80%), Н 19,5 усд. ед. (75%).П р и м е р 2. Берут сыворотку крови больного первичным билиарным циррозом печени (мужчина 29 лет), к 0,2 мл которой добавляют 2 мд 0,28%-ного раствора хлористого кадъшщ и 0,04 мл 1%-но. го раствора кристалдическоо гепарина. Полученный раствор инкубируют 4 мин и затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.Супернатант удаляют, к осадку добавляют 1 мл 0,85%-ного раствора хлористого натрия и помещают в кювету хемюпоыинесцентной установки, куда добавляют также 8 мл 120 мМ фосфатного буфера рН 7,4, К полученной суспензии липопротеидов низкой плотности добавляют 1 мл 25 мМ раствора двухвалентногб железа (ГЮГО,(. 7 НО). Возникает вспышка , хемюпоминесценции. Оптическая плотность сыворотки крови при.440 нм составляет 0,13, Параметры вспышки инициированной двухвалентным железом хемилюминес 56 унции 1 мл сыворотки крови равны: б 9 усл. ед., Ъ 15 усл. ед., 1 175 с; Н 3. усл. ед, соответственно хемилюмиВесценция липопротеидов низкой плотности иэ 0,2 мл сыворотки крови: 5 26,5 усл. едЪ 4,5 усл. ед., 1 35 с, Н 8 усл. ед,После искусственно вызванного гипо тоиического гемолиза оптическая плот ность сыворотки крови увеличилась до 2134,5 940062 6ного раствора хлористого кальция, 0,2 мл страции вспышки свечении, о т л и 1%-ного рас твора гепарина. ч а ю ш и й с я тем, что, с целью поПредлагаемый способ позволяет новы вышения точности метода путем устренсить точность регистрации хемилюминес- ния влияния гемолиза, сыворотку или ценции сыворотки крови и плазмы челове- % плазму крови предварительно обрабазыка и экспериментальных животных при вают растворами хлористого кальция и различной степени гемолиза и определить кристаллического гепарина и выделяют состояние перекисного окисления липидов липопротеиды низкой плотности.в организме больного. 10 формула изобретения Способ определения хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови путем до бавления двухвалентного железа и региИсточники информации,принятые во внимание при експертвзе1. Владимиров Ю. А. и др. Хемюиоминесценция сыворотки крови в присутствии солей двухвалентного желма. Вопросы медицинской химии. 1976,. М 2, с. 216- 223.Заказ 46 59/66 Тираж 887 Подписное ВНИИПИ Государственного. комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4