Способ получения сухого материала васillus тнuringiеnsis

(н)923491 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИяК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветсимхСоцмапмстмчеснмхРеспубпмн(22)Заявлено 11.12.78 (21) 2697229/30с присоединением заявки М -ом. кл, А 01 И 63 1 всударстваиных комнтвт СССР ао двлам нзвбрвтеннй н отхрцтнйОпубликовано 30, 04 . 82 . Бюллетень М а опубликования описания 30.04,82 2) Авторы изобретен сй и А.И.Михалев Г.М.Иванов,) Заявитея) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО МАТЕРИ ВАС 11 ДЛБ ТН 1 Ж 1%1 Е%15Изобретение относится к микробиологической промышленности и можетбыть использовано для полуцения посевного материала и поддержанияэнтомопатогенных микроорганизмов.Известен благоприятный субстратдля поддержания Вас 11 иэ 1 Ьцгпфепэ 1 э, которым является растертые трупики чувствительных к этим бактериямнасекомых, а именно гусениц тутовогошелкопряда 111,Известен также способ получениясухого материала и поддержания энтомопатогенных бактерий Вас. Нцг 1 щрепв 1 Б, заключающийся в заряжении бактериями чувствительных к ним насекомых,например гусениц сибирского шелкопряда. Погибших гусениц высушивают в эксикаторе над хлористым кальцием прикомнатной температуре в течениеМ10-12 суток, затем их растирают в порошок, в результате получают сухойматериал энтомопатогенных микроорганизмов. Поддержание их заключается в слудующем: иэ полученного сухого материала готовят суспенэию, затем 1 мл этой суспензии переносят в чашку Петри с расплавленным мясо-пептонным агаром и перемешивают, чашки с посевом инкубируют в термостате в течение 4.-6 суток. Затем из нескольких колоний, характерных для Вас. СЬиг 1 прхепйь чаг с 1 епс 1 го 1 ечыв производят посев на скошенный мясопептонный агар в пробирках, инкубируют в термостате в течение 4-6 суток, полученные культуры типируют, определяют чистоту культуры, выбраковывают .культуры, имеющие контаминанты, отбрасывают культуры других вариантов Вас,бшг 1 пддепз 1 з, после чего готовят суспензию чистой культуры, полученной суспензией заражают гусениц сибирского шелкопряда 21Недостатком известного способа является то, цто,насекомые всегда содержат в пищеварительном тракте и на поверхности тела разнообразные92349 50 микроорганизмы - контаминанты и другие варианты Вас Мшг 1 пфепь 1,поэтому при выделении культур изсухого материала, а также при заражении гусениц, необходимо осуществлять 5посев культур и их типирование,производить очистку культур от контаминантов, Способ весьма трудоемкий ипродолжительный, на выполнение егоуходит 440-584 цас. Кроме того, для 10осуществления известного способа необходимо использовать мясо-пептонныйагар. При определении результатовэтот способ несет в себе элементысубъективности и требует высокой 15квалификации исполнителя,Цель изобретения - исключение изсухого материала микроорганизмов -контаминантов, а также случайных вариантов ВаС, МИППд 1 ЕП 5 Ы, сокращение и упрощение числа операций,уменьшение трудоемкости и снижениетребований к опытности и квалифика"ции исполнителя.Поставленная цель достигается тем, 25что операцию заражения гусениц осуществляют с использованием стерильногокорма, который стерилизуют в автоклаве, затем смешивают с суспензией энтомопатогенных микроорганизмов и кор- З 0мят насекомых-гнотобионтов или заражают их погружением на 3-5 с в суспензию. П р и м е р 1. Ампулу с лиофильно 35высушенной дрожжеполисахаридной средой с культурой Вас,1 Ыг 1 пфепзЫСа 11 ег 1 ае (серотип У) вскрывают, наливают в нее пипеткой 1 мл стерильнойводы и взбалтывают в результате полу 40цают суспензию; которую вливают встерильную ступку, куда помещают3 г стерильного корма для гусеницСа 11 ег 1 а пе 11 опе 11 а, затем суспензиювместе с кормом растирают и переносят45в стерильную чашку Петри, куда помещают 15 гусениц - гнотобионтовСаПегха ве 11 опе 11 а У-У 1 возрастов ивыдерживают в термостате при 2830 С в течение 72 ч, Погибших гусениц переносят в стерильную колбуемкостью 50 мл с ватно-марлевойпробкой, колбу с трупами гусеницпомещают в термостат и выдерживают8 суток при 29-30 ОС, при этом ведутконтроль спорообразования, для этого из трупов гусениц готовят мазок,фиксируют на пламени спиртовки,, окрашивают фуксином и микроскопиру 1 4ют. Когда около 963 клеток завершают спорообразование в колбу с трупами гусениц заливают 30 мл стирильной воды и стеклянной палочкой трупы гемогенизируют, полученный гемогенат трупов стерильной пипеткой разливают по 2 мл в стерильные ампулы емкостью 5 мл, помещают в камеру лиофилизатора, сушат при 110 Т и минус 18 Со в течение 60 ч, затем из ампул удаляют воздух с помощью вакуум-насоса и при 1 10 Т и ампулы запаивают пламенем горелки. Контроль на присутствие контаминантов и случайных вариантов Вас.ййт 1 пд 1 епя 15 осуществляют следующим образом. Ампулу с лиофильновысушенным трупным материалом вскрывают, наливаютв нее пипеткой 2 мл стерильной воды,содержимое суспендируют и производят посев на скошенный мясо-пептонный агар в пробирках и чашках Петри, посевы инкубируют в течение 72 ч при 32 С, затем производят сравнение выросших колоний визуально и делают из 15 колоний мазки, фиксируют над пла-. менем спиртовки, окрашивают и микро- скопируют, готовят суспензию культур со скошенного агара в пробирках иосуществляют сероагглютинацию с сыворотками серотипов Вас. ййигхпд 1 епБ 1 з, в результате контаминанты в сухом материале не обнаруживают, суспензии культур со скошенного агараагглютинируют с сывороткой серотипа У и не агглютинируют с сыворотками других серотипов Вас. йЬцг 1 пд 1 епБАБ, следовательно случайные варианты Вас, 1 ЬдгхпфепБ 15 в сухом материале отсутствуют.П р и м е р 2. Ампулу с сухим материалом Вас йЬигпфепя 1 я айаг 6 а 11 ег 1 ае, полученным в примере 1, заливают 2 мл стерильной воды, содержимое ампулы суспендируют, после цего ее выливают в стерильную ступку, кудапомещают 5 г стерильного корма, всеперемешивают и растирают стерильным пестиком, инфицированный корм раскладывают в две чашки Петри, куда помещают по 15 гусениц-гнотобионтов У-У 1 возрастов. Далее операцию продолжают, как в примере 1 до получения сухого материала, В результате этого эксперимента контаминанты в сухом материала не обнаруживают, суспензии культур со скошенного агара не агглютинируют с сыворотками других сероТираж 699ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР.по делам изобретений и открытий .113035, Москва, К, Раушская наб., д. М 5 Заказ 2645/6 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,5 9234 типов Вас 0 шг 1 щ 1 епБ 1 э, а аглютинируют с сывороткой серотипа У,П р и м е р 3 С агаровой культуры Вас Нюппр 1 епз 1 я айаг Са 11 ег 1 ае делают смыв стерильной водой, из смы- % ва приготовляют суспензию, содержащую 32 мпн. спор в 1 мл, после чего 3 мл суспензии наливают в стерильную ступку, заФем гусениц-гнотобионтов СаПег 1 а пе 11 опе 11 а 1 У-У возрас О тов стерильным пинцетом на 3-5 с окунают в эту суспензию и по 10-15 особей помещают в четыре стерильные чашки Петри со стерильным кормом. Чашки с содержимым термостатируют при 28-30 фС в течение 72 ч. Последующие операции осуществляют как в примере 1 до получения сухого материала. После этого контаминантов и случайных вариантов Вас. 1 ЬгхпфепзЫ в су хом материале не обнаруживают. 91 6Формула изобретенияСпособ получения сухого материалаВас 111 ю й 1 ыг 1 пр.епзв включающий,приготовление суспензии бактерий,заражение насекомых и высушиваниепогибших насекомых, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью исключения попадания в сухой материалпосторонних микроорганизмов, а такжеснижения трудоемкости, для заражения используют безмикробных гусеницГа 11 ега пеПоне 11 а.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Африкян Э.К. Энтомопатогенныебактерии и их значение. Изд.АН Армянской ССР, Ереван, 1973, с. 238.2, Талалаев Е.В. К методике сох"ранения вирулентности споровых бактерий. нйикробиология", 1969, т. 38,6 (прототип).