Способ культивирования энтомопатогенных бактерий

(19) 111 за) А 01 И 63/О ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ ИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оп ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРпо делдм изов етений и Отк ы 1 тий,средах для пройзводства энтомопатогенных микробиологических препаратов"Микробиология", 1973, Р 9;2. Авторское свидетельство СССРпо заявке У 2777387/30-15,кл. С 12 К 1/06, 1979 (прототип).(54) (57) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯЭНТОМОПАТОГЕННЬЗХ БАКТЕРИЙ," включающий высев бактерий на среду, содержащую кормовые дрожжи, кукурузнуюмуку, гидрол, гидролизат хлопковогошрота и аэрацию в дробном режиме;о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения титра спор, культивирование осуществляют на среде,содержащей, вес.7.:Дрожжи кормовые2,0-4,0Мука кукурузная 1,2-2,4Гидрол 0,5-1,5Гидролизат хл кового шрота 3,0-14,0,Вода Остальноеа .аэрацию до полного спорообразова,ния поддерживают на уровне 0,33 -1,40 об/об мин и затем снижают доИзобретение относится к области технической микробиологии и может .быть использовано для получения энтомопатогенных препаратов, являющихся средствами защиты растений, 5Известен способ культивирования бактерий вида Вас, гйцгпцхепз 1 э в лабораторных условиях на дрожжеполисахаридной среде, содержащей Зкормовых дрожжей (БВК) и 1,5 кукуруз-, 1 О ной муки при постоянном режиме аэрации Г 1 3. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному является способ культивирования энтомопатоген ных бактерий на среде следующего состава, %: кормовые дрожжи 3,0-4,5 кукурузная мука 1,2-2,5; гидрол 2,0- 4,0 и гидролизат хлопкового шрота 3;4-6,8 с.содержанием аминного азота 2 о 300-400 мг% 2 3. Недостатком указанных способов является относительно низкий выход споровой биомассы энтомопатогенных бактерий.Целью изобретения является увели чение титра спор микроорганизмов. Это достигается за счет сокращения в составе среды количества гидрола и гидролизата хлопкового шрота при соответственном изменении режима аэрации, .заключающемся в снижении уровня аэрации в процессе культивиро,вания.В соответствии с предлагаемым способом энтомопатогенные бактерии выращивают на среде следующего сос- тава, вес. :Дрожжи кормовые, 2,0"4,0Мука кукурузная 1,2-2,4Гидрол0 ф 5-1 э 5 4 ОГидролизат хлопкового шрота 3,0-14Вода Остальное При этом уровень аэрации с начала процесса до момента полного споро."5 образования составляет 0,33 - 1,4 об/об мин, а с момейта Ьолного спорообраэования до момента освобождения спор у 10 .бактерий 0,15 - 0,5 об/об мин, после чего аэрацию 50 прекращают.Существо способа заключается в следующем,Предварительно готовят питательную среду. Для этого дрожжи и муку 55 смешивают с водопроводной водой в количестве 60 от необходимой для приготовления соответственного объе ма среды. Суспензию перемешивают, наогревают до 80 С и выдерживают при этой температуре 20 мин, далее добавляют ферментативный гидролизат хлопкового шрота, оставшуюся воду и охлажцают до 40-45 С. Доводят рН до 7,6+О, 1 20%-ным раствором БаОН. Срео ду стерилизуют при температуре 133 С в течение 30 мин, Отдельно готовят стерильный гидрол, Срерилизацию гидрола проводят при 120 С в течение 25 мин. Стерильный гидрол добавляют в среду непосредственно перед посе" вом культуры.Ферментативный гидролизат готовят следующим образом. Водопроводную воду нагревают до температуры 53+2 С, загружают 2 от взятой воды хлопкового шрота, добавлением раствора едкого натра устанавливают рН суспензии 8,0+0,2. После чего добавляют фер- мент протосубтилин ГЗХ (с активностью не менее 100 ед. по модифицированному методу Ансона) в, количестве 0,8-. 1 от навески шрота, Процесс гидролиза проводят в течение 4 ч при постоянном перемешиванни, поддержании температуры и,рН в указанных выше пределах, По окончании гицролиза суспензию нагревают до 80 С, выдерживаютйпри этой температуре 20 мин, после, чего мешалку отключают, после отстаивания гидролизата в течение 20 мин проводят его декантацию и с помощьювакуума:переводят в другой реактор.Готовый гидролиэат содержит около40 мгаминного азота. Подготовленную описанным выше способом питательную среду засевают штаммом энтомопатогенных бактерий, Культивирование осуществляют в течение 32"35 ч при дробном режиме аэрации. С начала процесса и до момента полного спорообразования обеспечиваютмаксимальный режим аэрации, составляющий 0,33-1,4 об/об мин в эависимости от объема ферментера, Моментом полного спорообразования счита-.ется такое состояние культуры, прикотором не менее чем у 95 . клетоксформировались зрелые споры, определяемые методом прямого микроскопирования. Затем интенсивность аэрации сокращается до уровня О, 15- 0,5 об/об мин и поддерживается на таком уровне до момента, при.котором не менее чем у 10 клеток освобождаются споры. После этого аэриро911 Корректор О, Тигор Техред М.Надь Редактор П.Горькова Заказ 7492/2 Тираж 721ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР ао делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", гужгород, улПроектная, 4 3ванне среды полностью прекращается и полученная культуральная жидкость направляется на переработку.П р н м е р 1. Готовят 7 л среды следующего состава,.вес.7:Дрожжи кормовые 4,0Мука кукурузная 2,0Гидрол 1,0Гидролизат хлопкового шрота 10,0 1 ОВода ОстальноеКультивирование проводят в лабораторном ферментере объемом 1 О л, Посев среды осуществляют суспензией спор бактерий Вас 111 цв гЬпгдп 81 епв 1 в чаг. яа 11 егдае шт. 69/6 в количестве6 30 мл с концентрацией спор 10 спор/мл.Непосредственно после посева обеспечивают интенсивность аэрации - 1 об/об мин, поддерживая ее на этом 2 О уровне до 22 ч роста. В этот момент 953 клеток содержит сформировавшиеся споры. После чего интенсивность аэрации снижают до 0,3 об/об мин и культивирование. продолжают еще 10 ч. 25 После 32 ч аэрации у 12 Х клеток споры выходят из культуральной жидкости и в этот момент аэрация полностью прекращается . Культуральную жидкость .выдерживают еще в течение 5 ч на холоде до полного освобождения спор от клеточньк оболочек. Титр спор составляет 9, 00 10спор/мл.П р и м е р 2. Культуру Вас,гЬогдпфепвдв ч, депйго 1 ыюв шт.87-продуцент дендробациллина выращивают в35 ферментере объемом 630 л на среде этого же состава, что и в примере 1, В течение 23 ч аэрацию поддерживают на уровне 1,4 об/об мин. На двадцать40 третий час 997 клеток содержит сфор:мировавшиеся споры и в этот момент 65 4интенсивность аэрации снижена до 0,5 об/об мин. В таком режиме. культивирование продолжается до момента. выхода спор у 157 клеток, что имеет место на двадцать девятый час куль.тивирования, После этого аэрацию полностью прекращают, в рубашку ферментера подают холодную воду и выдерживают культуральную жидкость в течение 5 ч до 98 Х. выхода спор из клеток. Титр спор составляет 10,08109 спор/мл.П р и м е р 3. Культуру Вас. гЬцг 1 п 8 з.епв 1 в ч. Оепого 11 пюв шт, 49/8- продуцент дендробациллина выращивают в ферментере емкостью 63 м на среде того же состава, что в примере 1. В течение 22 ч интенсивность аэрации составляет 0,33 об/об мин. На пвалиать втооой час 953 клеток сопеожит ".формировавшиеся споры и в этот момент интенсивность аэоапии чменьшена дб О, 17 об/об мин, В этом режиме культивирование продолжается до момента выхода спор у 102 клеток, что имеет место. на тридцать второй час культивирования, После этого аэрацию полностью прекращают, культуральнуюожидкость охлаждают до 20 С и выдерживают еще 3 ч. Титр спор составляет 9, 4 "10 спор/мл.Таким образом, предложенный способ культивирования бактерий вида Вас. гпог 1 епдепв 1 в может быть использован для получения энтомопатогенных препаратов на основе различньк вариантов этого микроорганизма как в лабораторных, так и в промышленных условиях.Предложенный способ обеспечивает повышение выхода спор по сравнению с промьппленно-освоенным способом более чем в 3 раза.