Способ получения антибиотического комплекса

Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет - (32) С 12 Р 1/06 ГосударствеиимВ комитет СССР ио делам июбретеиий и открмтий(53) УДК 615. 779931(088. 8) Иностранцы Роберт Куинси Томпсон, Уильям Макс Старк и Калвин Евгений Хиггенс(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГОКОМПЛЕКСА Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиковПредлагаемый антибиотический комп-лекс новый и способ егб получения внаучно-технической и патентной литературе не описан.Цель изобретения - получение антибиотического комплекса.Поставленная цель достигается тем,что штамм 5 сгерсовусез седеЬгаг 1 цкАТСС 17920 культивируют в глубинныхусловиях аэробно в питательной среде,содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при температуре 37-43 оС в течение 4-7 дней, затемвыделяют целевой продукт в свободномвиде или в виде его солей и при необходимости разделяют комплекс на сос-тавные антибиоические компоненты ф, 2 ОИ, 5 ,у и ф и переводят их в сали,Йовый антибиотический комплекс характеризуется наличием семи компонентов, из которых каждый отличаетсяактивностью, свойственной антибиотику,Этот комплекс, в качестве свободного основания растворим в воде идиметилсульфоксиде, слабо растворимв метаноле и нерастворим в большинстве других органических растворителей, таких как ацетон, высшие спирты,. диоксан, этилацетат, диэтиловый эфир, ацетонитрнл, метил-изобутил кетон ирастворители, относящиеся к классууглеводородов.Свободное основание комплекса усе тойчиво при пониженных температурахи температуре 37 С.Антибиотический комплекс тенебри"мицин содержит семь разлнчнйх факторов (компонентов:тенебримнцин Е, тенебримицин 1;тенебримицин 71, тенебримицин Щ тенебримицин , тенебримицин Д и тенебримнцин-В,В, комплексе, получаемом ттрн обычных условиях, тенебримицин 1 тенебримицин Е и тенебримицин Щ присутствуют в незначительных количествах, Тенебримнцин Е входит в состав в количестве 45-50 и тенебримицинсодержится в комплексе в количестве около 30, тенебримицин ф присутствует в количестве около 15-20, а тенебрнмицин % около 10.Тенебримиций Т являетСя белым ,твердым веществом. Электрометрическое титрование в водной среде пока20 884575 Таблица 2 Фракция Присутствукщий антибиотик Не активныТенебримицин 1,1 иТенебримицинНе активны Тенебримицин Б Тенебримицина Тенебримицин 3 со следами 173-249 250-256 Не активны т Тенебримицин Ч257-634 635-668 Не активныТенебримицин Я 669-698 В,еь)С этого момента элюат изменен до 0,3-н.гидрата окиси аммония. Формула изобретенияСпособ получения антибиотичесого комплекса, содержащего тенебримицин (, Ш, Ф , и Ч и их солей з а к лю ч а ниц и й с я в том,чтоштамм ЗО бсгероюусеь сепебгегдь АТСС 17920 культивируют в глубинных условиях аэробно в питательной среде, содерСоставитель С.МалютинаТехред С,Мигунова Корректор Н.Стец Редактор Н.Кончицкая Заказ 10272/89 Тираж 531 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д,4/5филиал ППП "Патент", г.ужгород ул.Проектная,4 1-34 35-53 54-77 78-153 154-172 жащей источники углерода, азота и минеральные соли при температуре 37- 43 С в течение 4-7 дней, затем выдеоляют целевой продукт в свободном виде или в виде его солей, при необходимости разделяют комплекс на составные антибиотические компоненты, Ч ии переводят их в соли.эывает наличие способных титроваться группировок, имеющих значениярН около 5,7; 6,7 7,7 и 8,7, Удельное вращение, определяемое в светелинии О натрия при 25 оС, обусловленное данным фактором, равна +159 , если концентрация антибиотика равна 1,считая иа весовое количество приходящееся на единицу объема в водномрастворе Данные микроорганизма свидетельствуют о том, что тенебримицинимеет приблизительно следующий процентный состав: С 46,47; Н 7,99; И13,05 0 32,29. Молекулярный вес, порезультатам титрования, составляетоколо 539. Эмпирическая формула15Инфракрасный спектр поглощения те-.небримицина 0 в среде, содержащейминеральное масло, показывает следующие различимые полосы в составеспектров инфракрасного поглощения в 20пределах от 2 до 15 мк: 3,02; 3,14;60,5; 6,23; 7,4; 8,5; 8,75; 9,17;Тенебримицин 1 образует ацетильное производное, имеющее удельное вра щение21 около 130 при концентрации соединения 1, считая на весовое,количество, приходящееся на единицу .объема в водном растворе. У производного не имеется оставшихся группировок, способных титроваться. Элементарный состав, определенный по методу микроорганизма, показывает, чток структуре тенебромицина 1 присоеди"няются четыре ацетильные группировки.Тенебримицинявляется основныивеществом, содержащим группировки,способные титроваться, имеющим значения показателя рК. а около 5,3; 6,8;7,8 и 9,0, судя по данным электрометрического титрования, в воде, 40Удельное вращение тенебримицииа фопределенное в 1-ном водном растворепри 25 оС, равно +114. Процентный состав тенебримицина й по данным микроанализа; С 41,91; Н 7,53 . М 15,16.4Молекулярный вес определенный поданным титрования - около 544. Эмпири.ческая формула для тенебримицина фСН Ибо,ц.Н О,6нфракрасный спектр поглощения те-небримицина Я в среде минеральногомасла показывает различные полосыпоглощения в пределах 2-15 мк составляют: 3,05 3,17; 585; 6,27 7,46;8,75 9,7 10,5; 11.,1 и 12,85 мк.Тетра-ацетильное производное тенебримицинаявляется твердым, кристаллическим веществом с точкой плавления около 265-267 оС. Удельноевращение Щ 1100 в том случае, есликонцентрация производного равна 1% в 60водном растворе./Электрометрическое титрование тенебримицинасвидетельствует о иаличии способных титроваться группировок, имеющих значение рК а около 5,5; 45 7,0 8,0 и 9,1. Удельное вращениев свете 0 линии натрия в однопроцентном водном растворе данного фактора,определяемое при 25 С, +118 . Элементарные составы, определенные по методу микроорганизма, таковы: С 43,21;Н 7,86; М 13,69. Молекулярный весравен 483. Эмпирическая формула длятенебримицина Ч С 8 НМО НО.Спектр инфракрасного поглощениятенебримицина 7 в среде, содержащейминеральное масло, имеет следующиеразличные полосы в пределах 2-15 мк,3,05; 3,19) 6,32; 7,45; 8,75; 9,7;11,35 и 12,25,мк.Подобно тенебримицину Ж , тенебримицин М образует кристаллическоететра-ацетильное производное. Производное плавится с разложением притемпературе около 260 С и характеориэуется удельным вращением Щ около +190 о, при концентрации 0,42 вводном растворе,Тенебримицин Я имеет способныетитроваться группировки, характеризуемые значениями рКа около 5,6;7,2; 8,2 и 9,3, определенными в водном растворе путем электрометрического титрования. Молекулярный вес 467.Удельное вращение в свете 0 линиинатрия в однопроцентном водном растворе тенебримицина Д при температуре 25 С равно, примерно127. Микрооанализы свидетельствуют о приблизительном процентном составе: С 44,3;Н 8 у 1 р М 14 р Зу 32 р 8 Эмпирическаяформула СНЙ 09НО.Спектр инфракрасного поглощениятенебримицина 1 показывает различные полосы поглощения в пределах2-15 мку 3,05; 3,19; 6,35; 7,47;8,75, 9,8; 12,3 и 12,95 мк.Показатель удельного вращения тетра-ацетил производного тенебримицина ф в 1-ном водном растворе составляет около+95 о при определении при25 С.Соли, являющиеся продуктами присоединения кислот к тенебримицину илиотдельным компонентам,входящим всостав антибиотика, можно получитьс помощью обычных методов. Для образования соли примейяют или органические или неорганические кислоты.Удобный метод получения таких солейзаключается в добавлении раствора,кислоты, служащей для образованиясоли к водному раствору антибиотика.В случае нерастворимых солей, являющихся продуктами присоединения кислоты, соль осаждается иэ раствора илегко отделяется с помощью обычныхтехнических приемов, таких как фильтрование или центрифугирование. В томслучае, когда желаемая соль, являющаяся продуктом присоединения кислоты, быстро не осаждается, то процессу осаждения можно способствовать иликонценярируя раствор до меньшегообъема или добавляя к воде смешивающийся с ней растворитель, такой какацетон или подобный ему. Соль, являющаяся продуктом присоединениякислоты, можно перевести и Форму свободного основания путем пропусканияводного раствора соли над анионообменной смолой н гидроксильном цикле.Различные факторы, образующие тенебримициноный комплекс можно отличитьодин от другого,а также от других антибиотиков, обладающих сходными свойствами с помощью технйческих приемов бумажной хроматографии. ХроматограФиюпроводят по обычному нисходящемуметоду при температуре 22,80,6 С.73 ОФ+1 фф), на бумаге фирьы "Ватман" 15Р 1, имеющей размеры 19,1"46,3 см.Антибиотический комплекс тенебримицина, а также индивидуальные, образующие упомянутый комплекс, обладают ингибирующим действием по отношению к росту микроорганизмов,патогенных для жизнедеятельности животных и растений. Концентрация комплекса и индивидуальных тенебримицинов, при которых проявляется тормозящее действие в части развитияряда организмов, показано в табл.1.Минимальные ингибирующие концентрации определяют по методу разбавленияагара.ЗООстрая токсичность тенебримиционного комплекса и сравнительно менеераспространенных его составных частей определяют на мышах. Значениядоз "0"50 вызывающих гибель подопытных животных в 50 случаев длятенебримицинсульфата, составляютоколо 300 мг/кг для случая внутреннего введения, и около 350 мг/кг привведении в брюшную полость. Все мышивыживают в случае дозировок при подкожном введении в количестве750 мг/кг или при скармливании5600 мг/кг. Не отмечается значительного раздражения при внесении в одинглаз каждой из четырех крыс одной 45капли 50-ного водного раствора сульФата тенебримицина по три разавдень в течение 5 дней. Получаютследующие значения "Ор", выраженныев мг/кг свободного основания для индивидуальных тенебримицинов при внутривенном введении для мышей:тенебримицин Й около 385, тенебримицин 1 Ч около 220,тенебримицин Ч около 140 и тенебримицин ф около 120.Новый антибиотический комплексполучают в результате культивирования подходящего штамма антиномицетного организма при аэробных условияхна пригодной для культивирования среде до тех пор, пока такая среда небудет обладать значительной активностью, характерной для антибиотика. Тенебримицин можно извлечь, применяя для этой цели различные методы 65 выделения и очистки, нанес". ле н производстве антибиотиков, Комплекс антибиотика может применяться., как таковой или же его можно подвергать дополнительным операциям для очистки с целью выделения различных его индивидуальных компонентов с более высокой степенью чистоты,Штамм представляет собой образующую спираль, устойчивые к воздействию тепла, аэробные по отношению к микроаэрофильным "5 сгерсощусеь" споры, имеющие продолговатые гладкие стенки, они ингибируются при искусственном освещении сравнительно небольшой интенсивности. Штамм 5 сгерсощусеь йепеЬгаг 1 цввыделен из образца почвы посредством суспендиронания отдельных порций почвы в стерильной дистиллированной воде с последующим переносом суспензий на питательную среду, образованную агаром, Засеянные пластинкис питающей средой в виде агара инкубируют при 25-35 С до тех пор, покане обеспечивался рост. К концу периода инкубиронания колонии организмов,вырабатывающих антибиотик, переносятс помощью стерильной платиновой петли на скошенный агар, затем инкубируют с целью обеспечения достаточныхколичестн прининочного л;атериала дляпроизводства антибиотика. Шталя организма, применяемого для производствакомплексного антибиотика помещенана постоянное хранени: н коллекциюкультур американского типа н Вашингтоне (Федеративный округ КолумбияСША, кУльтУре присвоен Р АТСС 17920,Морфология.При выращивании на пептоновом агаре по Чапеку разветвленные форлы споробразуются н виде беспорядочных пучков и гроздьев на воздушном мицелии.Изолированные споры наблюдаются редко. Мицелий в целом неповрежденномвиде, легко отделяется от субстрата.Цепочки созревших спор обычно образуют 5-6 открытых спиралей. Спорыимеют продолговатую форму, доходящуюдо цилиндрической. При исследованиИпод электронным микроскопом спорыкажутся гладкими, имеют размеры от0,7 до 1,3 и от 2,0 до 2,1 мк.На среде по Беннату наблюдаютсяутолщения.Агар Чапека: характеристика роста;редкий, разбросанный; воздушный мицеллий,редкий; светлый, оранжевожелтый спорообразование удовлетворительное; субстратный,мицелий; светлый, оранжево-желтый, растворимыйпигмент слегка розовый,Пептон по Чапеку: обильный рост; ноздушный мицелий обильный, светлый,желтовато-коричневый с баль.ми участками обильное спорулиронание; субстратный мицелий светлый, красновато 884575серый, растворимый пигмент; сероватороэовый.Агар, содержащий кальциевую соль,яблочной кислоты, рост умеренный,воздушный мицелий умеренный, светлый,оранжево-желтый спорообразование умеУ5ренное, субстратный серовато-розовый,растворимый пигмент серовато-розовый.Агар тирозиновый: рост ограниченный, скудный, воздушный мицелий скудный,светлый оранжево-желтый, спорулирование незначительное субстратныймицелий светлый, оранжево-желтый,растворимый пигмейт отсутствует.Агар, содержащий неорганическиесоли и крахмал: рост умеренный, воздушный мицелий умеренный, коричневато-розовый с белыми участками, спорообраэование обильное; противопопожный цвет светло-желтый, растворимыйпигмент светло-желтый.Агар, содержащий глюкозу и аспарагинф, рост умеренный, воздушный мице,лий умеренный, светло-желтый с белымиучастками,спорообразование умеренное,субстратный мицелий светло-желтый растворимый пигмент отсутствует. 25Томатная паста - овсяная мука:рост обильный, воздушный мицелийобильный, светлый желтовато-коричневый, спорообразование обильное, субстратный мицелий темно"серый, красновато-коричневый растворимый пигмент темный, пурпурно-красный.Дрожжевой экстракт: рост обильный,воздушный мицелий обильный, светлый,оранжево-желтый с белыми участками;спорообразование обильное, субстрат.ный мицелий.умеренно-желтый растворимый пигмент отсутствует.Питательный агар: рост редкий,разбросанный, воздушный мицелий редкий, белый, спороббразование ред Окое, субстратный мицелий сероватозеленовато-желтый, растворимый пигмент отсутствует.Агар по Беннетуг рост умеренный,воздушный мицелий умеренный белый,спорулирование умеренное, субстратный мицелий светло-желтый, раство. римый пигмент отсутствует.Действие на молоко: толстое желтое кольцо роста на поверхности. 50Наблюдается коагуляция и пептонизация. Нитраты восстанавливает, сероводород не образует, желатин полностью разжижает через 14 дней.Требования в отношении температуры при выращивании на нептоновом агаре по Чапеку:20 О - рост отсутствует;26 рост. удовлетворительный, воздушный мицелий отсутствует;30 рост и образование воздушного 60мицелия умеренные, однако спорообразование отсутствуете37 рост, образование воздушногомицелия и спорообразование всеобильное, 65 43 рост, образование воздушногомицелия и спорулироваииеобильно )50 рост, образование воздушногомицелия и спорулирование - всеобильное;55 рост скудный, ограниченный,60 рост отсутствует.Споры, образованные из суспензииспор, нагреваемой при 75 оС в течение 15 мин остаются жизнеспособными.В случае нагревания суспензии спордо 100 ОС в течение 15 мин жизнеспособных спор -не остается.Красный растворимый пигмент вырабатывается лишь в присутствии ионатрехвалентного железа, причем интенсивность пигментации пропорциональна концентрации иона трехвалентногожелеза в заданных пределах,физиологические свойства; усваивает рибозу, фруктоэу, маннозу, глюкозу, мальтозу, сукроэу, трегалозу,инозитол, салицин. Не усваивает арабинозу, рамнозу, ксилозу, лактозу,раффиноэу, целлюлозу, инсулин, маннитол, с -сорбитол.Штамм 5 г.ерсовусея епеЬгаг 1 цяАТСС 1720 культивируют с помощью обычных приемов в условиях погруженнойаэробной культуры в среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганических солей.Штамм растет хорошо при темпера-.туре рт 30 до 50 С. Оптимальной является температура 37-43 оС. Организмы,чувствительны к действию света и плоХо растут при освещении. Через средудля выращивания культуры продуваютстерильный воздух. Объем воздуха, используемый в процессе ферментациив резервуарах составляет свыше0,1 об/мин на 1 объем средь: для выра.щивания культуры.Концентрация, характеризующаяактивность антибиотика в ферментационной среде может быть легко прослежена по мере хода ферментации посредством отбора и испытания проб среды для выращивания на их активностьв отношении ингибирования роста организмов, которые должны тормозиться в своем развитии в присутствиитенебримицина. Для этой цели применяются два организма: К 1 еЬ 1 е 11 арпецаоп 1 ае и М 1 соЬасйег 1 цв Ьцйуг 1 сцв,Максимальный уровень производства активности антибиотика достигаетпримерно через 4-7 дней после инокулирования среды для выращивания культурыв случаях примененИя культур, выращиваемых в аэробных условиях погружения илиже в стеклянной посуде, содержимоекоторой перемешивается при встряхивании. Несколько более длительноевремя затрачивается при использовании пбверхности культуры.Мицелий и нерастворившиеся остатки удаляют из ферментационного бульона с помощью обычных средств, таких как фильтрование или центрифугирова- ние. Характеризующее антибиотик активное начало содержится в профильтрованном бульоне и может быть извлечено из него путем применения адсорбци иной техники. К числу абсорбентов, которые могут быть применены с наибольшим успехом относятся катионнообменные смолы, например И 1 ВСф.Извлекают тенебримицин из ферментационного бульона следующим образом. Бульон отфильтровывают с применением средства, способствующего фильтрованию, после того, как показатель концентрации водородных ионов рН смесиснижен приблизительно до рН 2 посредством добавления кислоты, такой как серная кислота, фосфорная кислота, хлористоводородная кислота и подобные им. После этого значение рН фильтрата доводят примерно до рН 5,5 путем добавления концентрированнойщелочи и смесь снова фильтруют. Полученный фильтрат пропускают через ионообменную колонку, заполненную ионообменной смолой, такой как "1 ЙС" в аммонийном цикле. Затем колонку промывают дистиллированной водой и активное действующее начало, характеризующее антибиотик, извлекают с адсорбента посредством вымывания разбавленной кислотой Фракции, содержащие активное действующее начало, объединяют и концентрируют приблизительно до 1/20 от первоначального объема. Значение показателя рН концентрата повьааают примерно до рН 11 путем добавления концентрированной щелочи, после чего щелочный концентрат выливают примерно в шестикратный объем ацетона, хорошо перемешивают и охлаждают. Выделяющийся осадок, не обладающий активностью в микробиологическом отношении, устраняют с помощью фильтрования. Значение показателя рН фильтрата понижают приблизительно до рН 3,5 путем добавления 20-ной серной кислоты при тщательном перемешивании. Тенебримицин в виде комплекса осаждается в форме сернокислбй соли, в то время как керуломицин, попутно образующийся в процессе ферментации, остается во всплывающем слое, кото- . рый отбрасывается. Сернокислую соль тенебримицина растворяют в минимальном количестве воды и водный раствор пропускают через колонку с "Доуэксом" 1 х 1., Водный раствор сульфата тенебримицина доводят в колонке дистиллированной водой, после чего жидкость, вытекающую из колонки, собирают в виде отдельных фракцийАктивные фракции объединяют и концентрируют до консистенции густого сиропа, за 1 ем высушивают с целью получениятенебримицина в виде свободного основания.Основные факторы, образующие комплекс тенебримицина можно получить,если это желательно, в. виде раздельных антибиотиков посредством дополнительного фракционирования на колонках, заполненных ионообменной смолойтенебримицина. Для проведения фракционирования тенебримицин применяют 1 О в виде соли, являкщейся продуктомприсоединения кислоты. Пригодной солью является в данном случае сульфат. Раствор сульфата теиебримицина удобно получать посредством при готовления 20-ного водного раствора тенебримицина с последующей установкой показателярН раствора приблизительно до рН 4,5 путем добавления серной кислоты. Окрашенные при меси можно удалить с помощью перемешивания приготовленного раствора примерно с 5 (весовое количество по,отношению к объемному) активирванного угля, например фДарко 6-60". Эффективное обеспечение обычно достигают в результате перемешивания сме. си, содержащей автивированный угольв течение приблизительно часа. Послеэтого смесь фильтруют и фильтрат, который содержит сульфат тенебримнцинапомещают в колонку, заполненную ионообменной смолой марки "1:ВС" в аммонийном цикле. Колонку промывают водой,после чего индивидуальные антибиотики, образующие комплекс тенебримицина фракционировано отмывают с адсорбента с помощью 0,1-н. раствора гидрата окиси аммония. Процесс элюирования происходит медленно, и для получения необходимого эффекта фракциони рования комплекса обычно необходимоочень большое число фракций. Так,например, полное и законченное фракцнонирование примерно 250 г тенебримицина требует получения около 700 45 фракций, каждая из которых содержит,ся примерно в 900 мл жидкостиотмываемой с адсорбента.Первые из числа полученных активных фракций содержат тенебримицин50 11 и Ч, За ними следуют серии активныхфракций, в которых содержится в качестве единственного антибиотикатенебримицин. Прежде чем будут открыты фракции, содержащие тенебримицин У, вслед за элюированием тенебримицина иотходит ряд фракций, необладающих активностью. Первые фракции, содержащие тенебримицин 5 , содержат следы тенебримицина а . Тенебрнмицин 9 получают из колонки в 60 составе активных фракций, за которыми следует тенебримицин ) . Для получения тенебримицина Й колонку дополнительно элюируют более концентрированным раствором гидрата окиси 65 аммония, после того как весь тенебримицин 7 извлечен из колонки. Подходящей жидкостью для отмывки с абсорбента тенебримицина Ю служит 0,3-н.раствор гидрата окиси аммонияП р и м е р 1. Ферментация 5.тепе.Ьгаг 1 ов штамма АТСС 17920.Спорулированную культуру 5,г.епеЬгаг 10 ь АТСС 17920 получают посредством выращивания организма на модифицированной среде Беннета в виде скошенного агара, имеющего следующий состав, г:Декстрин 10Дрожжевой экстракт ("Дифко") 1Гидролиэованный казеин 2Экстракт из мяса крупного рогатого скота("Дифко") 1СаС 1,1 6 Н 10 0,01Промытый агар 20Деиониэированная вода н количестве, необходимом для доведения объема смеси до 1000 млЗначение показателя концентрацииводородных ионов рН доводят до рН 7до автоклавиронания.Скошенную среду засевают спорами5, гепеЬгаг 1 цз АТСС Р 17920 и культивируют в отсутствии видимого света в течение пяти дней при 37 С.Культуру, выращенную на скошенной среде покрывают водой и наклонную по.-верхность осторожно соскабливают,удаляя споры с целью получения водной суспенэии, содержащей споры,Полученную указанным образом суспензиюспор применяют для инокулированиясреды, имеющей такой состав, Ъ:Декстроза 0,05Питательная соевая мука,содержащая 35-45 Ъ диспергирующегося протеина 1,5Декстрин 700 (картофельный)Декстрин с низким содержанием хлоридов 1Хлористый калий 0,1ИЕ-амин А 0,3КНР 04 0,05М 9504 7 НО 0,5СзС 11 2 Н 0 0,025Деиониэированная вода 100 млИнокулиронанную вегетативную среду инкубиру 10 т при температуре около370 С в течение 16 ч на аппарате дляперемешинания путем встряхивания приодновременном вращении со скоростью250 об/мин при размахе колебанийб 3,2 мм.Для инокулирования резервуара дляпосева емкостью 44 л, содержащего водную среду следующего состава:Декстроза 1Соевая крупа 1,5КНРОс 0,05И 9504 0,5Хлористый калий 0,1СаС 1 2 НО 0,025,Средство против вспенивания 0,025применяют порцию вегетативной культуры объемом 50 мл. Среду, находящуюся н резервуаре для посева стерилиэуют при 120 фС в течение 30 мин.Инокулированную среду в резервуаредля посева инкубируют при 37 С втечение 12 ч. Перемешивание со скоростью 370 об/мин начинают немедленно после инокулиронания. В продолжении всего периода инкубированияосуществляют аэрацию при скоростиподачи воздуха 0,22 мЭ/мин.К концу периода инкубации содержимое резервуара для посева используют для инокулирования ферментатораемкостью 1,14 мнили 0,95 м, содержащего среду следующего состава,Ъ;Декстроза 415 Соевое масло рафинированное 3Соевая мука 3Хлористый аммоний 0,5Хлористый кальций 0,3Сернокислый магний 0,22 О Азотнокислый аммоний 0,1й 2-амин-А 0,5Средство против образованияпены 0,2-,Депонизиронанная водаДо инокулирования ферментационнуюсреду стерилизуют 30 мин при 120 С.оферментацию проводят при 37 С. Аэрацию осуществляют при скорости подачи воздуха 0,48 м/мин н течение всего периода выращивания, начиная отинокулированияи кончая сбором выращенной культуры. Перемешивание начинают при скорости вращения мешалки120 об/мин. Через 12 ч число оборотовмешалки унеличинают до 180. ПроцессФерментации продолжают 5 дней. Бульон,содержащий культуру, после проведения ферментации фильтруют для удаления мицелия и других нерастворившихся твердых веществ. Профильтрован 4 О ный бульон содержит активность антибиотика при концентрации около680 ед. в мл.П р и м е р 2, Изолирование комплекса тейебримицина.Значение показателя концентрацииводородных ионов у 880 л ферментационного бульона, содержащего антибиотик и полученного, как указанов примере 1, понижают приблизительно до рН 2 путем добавления приблизительно 10-15 л 20-ного водногораствора серной кислоты. К подкисленному бульону добавляют 45 кг средства, способствующего фильтрованию,тщательно перемешивают смесь и Фильтруют, Отжатый осадок, оставшийся нафильтре промывают водой и промывныеводы добавляют к фильтрату.Значение показателя рН фильтратадоводят до рН 5,5 посредством добав 60 ления 50-ного водного раствора гидрата окиси натрия. Добавляют примерно 4 кг средства, способствующегофильтрованию, смесь тщательно перемешивают и Фильтруют. ПолученныйЯ Фильтр пропускают.через колонку, имеющую размеры 10,2 смн 1,8 м, заполненную ионообменной смолой марки фРСф. Колонка имеет слой смолы высотой 111,7-114,3 см и действует по аммонийному циклу. После того, как весь фильтрат пропустят через колонку, 5 . последнюю промывают дистиллированной водой в количестве около 200 л. Активно действующее начало, характеризуемое свойствами антибиотика затем от мывают с адсорбента в течение 12-15 ч 1 О примерно 150-175 л и 0,1 н. раствора серной кислоты. Элюат собирают в виде фракций по 10 л каждая. Присущая антибиотику активность в составе злюата становится распознаваемой в случае снижения величины водородного по казателя рН до 4 или несколько менее. , По мере продолжения отмывки, водородный показатель элюата продолжает снижаться до тех пор, пока его значение не достигнет уровня около рН 1,5. 20 Фракции, содержащие активное начало.антибиотика объединяют и концентрируют при уменьшенном давлении приблизительно до 1/20 от первоначального объема. 25Значение водородного показателя рН концентрированного элюата доводят до рН 11 посредством добавления 50-ного водного раствора гидрата окиси натрия, после чего подщелоченный концентрат добавляют к б объемам ацетона. Полученную смесь охлаждают и отставляют в сторону для того, чтобы дать отделиться осадку, лишенному активности, свойственной антибиотику. З 5 Затем смесь Фильтруют и плотную массу отжатую на фильтре, и состоящую из неактивного осадка, отбрасывают.Значение водородного показателя рН устанавливают до 3,5 посредством до- бавления, при тщательном перемешивании, 40 20-ного водного раствора серной кислоты. Во время такой обработки комп.- лекс тенебримицина осаждается в виде сульфата. Практически полное осаждение достигается, когда рН раствора 45 достигнет значения около 4 или несколько менее. Смесь фильтруют и фильтрат, содержащий церуломицин, попутно образующийся в процессе Ферментации, отбрасывают. 50Отжатый на фильтре осадок, являющийся сульфатом тенебримицина, растворяют в минимальном количестве воды и охлаждают. Все твердые вещества, растворяющиеся более или менее трудно,55 отбрасывают, наряду со всеми твердыМи веществами, выпадающими в виде осадка или кристаллизующимися при охлаждении, прозрачный раствор сульфата тенебримицина пропускают через насадку из ионообменной смолы марки 60 фДоуэкс 1 х 1" размером 10, 2 см х 2, 1 м. Раствор антибиотика выводят из колонны с применением 40-50 л дистиллированной воды. Жидкость, выходящую из колонны собирают отдельными фрак циями по 10 л, Активные фракции объединяют, концентрируют в вакууме до консистенции густого сиропа, который, после высушивания на противне дает сухой тенебримицин.П р и м е р 3. Сульфат тенебримицина получают путем добавления концентрированной серной кислоты к 20-ному водному раствору, содержащему 258 г комплекса тенебримицина в виде свободного основания с таким расчетом, чтобы значение водородного показателя рН среды стало равным 4,5. Полученный таким путем раствор сульфата тенебримицина обесцвечивают, перемешивая его примерно один час с 5 (весовое количество по отношению к объемному) активированного угля марки "Дарко 6-60 ф. Затем раствор фильтруют и Фильтрат пропускают через колонку размером 9 х х 105 см заполненную примерно 7 л ионообменной смолы марки "РС" и работающую в аммонийном цикле. После того, как фильтрат, содержащий соль антибиотика, пропустят через колонку, ее проьывают приблизительно 17 л деиониэированной воды. Вымывание активной части антибиотика, задержанной в колонке начинают с помощью 0,1 н. раствора гидрата окиси аммония, подаваемого со скоростью окало 20 мл в мин. Элюат собирают отдельными фракциями приблизительно по 900 мл, причем каждую Фракцию проверяют на микробиологическую активность, Фракции, содержащие одинаковый фактор антибиотика объединяют и высушивают из замороженного состояния с .целью пблучения индивидуальных высушенных тенебримицинов. Индивидуальные тенебримнцины распределяются, в зависимости от активности Фракций следующим образом табл.2).П р и м е р 4. Получение гелиантатов тенебримицинов.Готовый раствор 2 г тенебримицина Й в 22 мл воды н водородный показатель раствора доводят до значения рН 5 посредством добавления 50-ной серной кислоты. Затем к раствору антибиотика добавляют горячий 10-ный водный раствор метил-оранжа, Гелиантат тенебримицина Ц выделяют в виде осадка и отделяют фильтрованием. Твердую соль тщательно промывают горячей водой и высушивают в вакууме. В итоге получают 3,5 г тенебримицин Й гелиантата.П р и м е р 5. Окончательная очистка факторов тенебримицина.Готовят гелиантат тенебримицинав соответствии с методикой, аналогичной описанной в примере 4. Четыре грамма приготовленной таким путем соли суспендируют приблизительно в 200 мл воды, значение водородного показателя которой доведено доН 2 за счет добавления серной кислоты. Смесь перемешивают рколо 4 чпосле чего фильтруют ее через ворон:ку с фильтрующей пористой стеклянной пластинкой средней степени пористости с целью удаленщя гелиантовойкислоты. Фильтрам обесцвечивают путем пропускания через тонкий слойактивированного угля, после чегопропускают через колонку размером1 х 32 см, наполненную ионообмениойсмолой фДоузкс 1 х 2 ф и работаницуюв гидроксильном цикле. Фильтратзамещают в колонке с помощью дистиллированной воды с целью завершенияотмывки активного действующего начала антибиотика. Выходящую из колонкижидкость собирают отдельными фракциями, объединяя вместе активные фракции. В заключение производят высушивание в замороженном состоянии. Полученный остаток представляет сухой антибиотик. Остаток, растворяют приблизительно в 15 мл воды и полученный раствор пропускают через колонку размером 1 х х 25 см, заполненную ионообменной смолой, фБио Рад смола А 6 11 А 8", Это смола задерживающего действия. Активную составную часть, обладающую свойствами антибиотика, вымывают из колонки дистилированной водой. Активные фракции снова объединяют и высушивают в замороженном состоянии. Выход тенебримицина М высшей степени очистки - около 700 мг.Предлагаемый способ позволяет получить новый антибиотический комплекс, который найдет применение в медицине.а а о а а а аСЧ а СЧ СЧ с СЧ а сч - " счо СЧ аО с 1 ЧР с 3 "3 О 3 Л ОЪ ОЪ с сч сч ас"3:3 1 1 В 1 1 ХР,1 31 131 О 1 1 Э 1х 1 Ф 1 9 1 11 6 1 11 1 Е 31 Х 1 Х 1 Х 161: 1 б 1О 1 ХЮ 1 1 хР 1 1 1 О 1 1 Ю 6 1 а ХЯ 1 Э 1 Й 1 Е 3 1 1 1 1 1 Р РО 1 1 1 Х 1 1 1 1 1 Х Х 1 1 Х 1 ф 11 Х 1 Х 1:11 331 Р 1 11 О, 131 Х 1 Х 91Х 1 А 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Х 3 1 Х 1 1 Р 1 О 1 1 Э 1х1 Э 11 Е 3 1 сч О 3 ОР сч а Оъаа 3 Л ес сСЪ -3 г 3 СЪ "1 а 3ч ч а ю а сч СЧ ОЪ СЧ г 4с са а Ю -3 О 3 М СЧ СЧча 3 О О 3 3 с 3 сч а О 3 аа а 1,33 т.3 г 3 СЧ СЧч ч ч а 3 о о сч сч а 3 л ссО О Ю г 3 е 3 СЪ ОЪ ОЪ ч ч