Способ очистки 5 -экзонуклеазы actinomyces coelicolor от фосфомоноэстеразы

Сефз Советскик Сфцнеектическнк РеспубликОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ВТННвСТВУ щ 825540(5)М. Кл. с присоединением заявки Нов С 07 6 7/028С 12 0 13/101С 07 Н 19/00 Госукарственнцй комитет СССР яо дмам нзобретеняй к открмтий(72) Авторы 154) СПОСОБ ОЧИСТКИ 5 -ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ АСТНОИУСЕЬ СОЕ 1.С 01.0 Й ОТ ФОСФОМОНОЭСТЕРАЗЫ 30 Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано при получении 5-экзонуклеазы, не содержащей примесей фосфомоноэстеразы. 5 -экзонуклеазу используют для получения 5 -нуклеотидов путем гидролиза нуклеиновых кислот. Примесьфосфомоноэстеразы вызывает практически исчезновение 5 -нуклеотидов из реакционной смеси за счет дальнейшего превращения их в нуклеозиды.Известен способ очистки 5 -экзонуклеазы из Асс 1 поеусеь сое 11 со 1 ог шт.Азт фосфомоноэстеразы.Очистка 5 целевого Фермента включает хроматографию на сефадексе 6-75,диэтиламиноэтилсефадексе А, диализ, после чего полученный ферментный раствор прогревают в присутствии 2-меркаптоэта. иола при 37 оС и рН 5,5 в течение 40- 90 мин, Далее проводят фракционирование, т.е. разделение ферментов хроматографией на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А. 2-Меркаптоэтанол, добавляемый при прогреве ферментного раствора, играет роль стабилизирующей добавки дляэкзонуклеазы, вызывая в то же время резкое уменьшение стабильности фосфомоноэстеразы.Соотношение 5-экзонуклеаза /фосфомоноэстераза после ф акционирования составляет 10000 11Недостатком известного способа является многостадийность, а также наличие примесей фосфомоноэстеразы в целевом продукте. Кроме того, данный способ может быть реализован только в лабораторных условиях вследствие большого числа трудноосуществимых хроматографических операций. Цель изобретения - упрощение технологической схемы процесса и улучшение качества получаемого продукта, т.е. более полная очистка от Фосфомоноэатеразы.указанная цель достигается способом очистки 5-экзонуклеазы Асс 1 поаусеь сое 11 со 1 ог от фосфомоноэстеразы, который заключается в прогревании ферментного раствора в присутствии стабилизирующих добавок - сульфата аммония и РНК при 45 - 50 С в течениео 49-90 мин и двухстаднйном Фракционироваиии ацетоном соответственно 0,5 и 2,0 объемами по отношеннк к объему исходного раствора с отделцпием пос 825540ле первой стадии осадка фосфомоноэстеразы,В способе предпочтительно используют 5 -экзонуклеазу Асповусеь сое)со(ог шт. А, причем обычно ввиде. 4-6-ного раствора в 0,005 Мтрос-НС буфере, содержащем 10 И 9 С),Сульфат аммония обычно используютВ количестве 8-11 от насыщения, арибонуклеиновую кислоту - 0,9-1.Способ осуществляют следующим образом.Штамм-продуцент Ас. сое 1(соогвыращивают на подходящей питательнойсредне при 30 фС в течение 48 ч, фильтруют и из охлажденного раствора осаждают неочищенный Фермент 5 -экзонуклеазу при добавлении 2,5 объемов ацетона,Соотношение единиц 5 -экзонуклеазной и Фосфомоноэстеразной активностей находится в пределах 10 - 100.Для очистки от Фосфомоноэстеразы препарат растворяют в буфере рН 6,6, краствору добавляют РНК (на одну весовую часть фермента 0,2 вес.ч, РНК) исульфат аммония в количестве 57 г/л,т.е. 10 от насыщения. Смесь имеетрН 4,7, ее нагревают до 50 С и выдерживают 40-90 мин, затем охлаждают и/определяют соотношение 5 -экзонуклеазиой и Фосфомоноэстеразной активностей, Установлено, что оно находитсяв пределах 2000-10000. К раствору.добавляют 0,5 объема ацетона и центрфугируют, из супернатанта осаждают5 -экзонуклеазу добавлением еще 2,0объемов ацетона. Осадок фермента высушивают. Выход 5-экзонуклеазы составляет 45-50 от неочищенного препарата. Фосфомоноэстеразная активностьне проявляется при инкубации фермента с субстратом в течение 3-х ч идесятикратной концентрации Ферментав инкубационной смеси,В опытах по гидролизу РНК с анализом продуктов гидролиза методом тонкослойной хроматографии обнаруживаются только нуклеотиды, а нуклеозидыполностью отсутствуют,Следовательно, очищенный Ферментный препарат пригоден для получениянуклеотидов из нуклеиновых кислот.Предлагаемый способ основываетсяна том, что при тепловом воздействиипроисходит денатурация, главным образом Фосфомоноэстеразы, за счет чегои происходит очистка 5 -экзонуклеазыот этой примеси, Обнаружено, что добавление рибонуклеиновой кислоты исульфата аммония приводит к избира)тельной стабилизации 5 -экзонуклеазы,благодаря чему фермент выдерживаетоболее высокую температуру (до 50 С)в сравнении с известным способом(37 С). Кроме того, согласно известному способу, 5 -экзонуклеаза неус(тойчива при рН ниже 5,0. В предлагаемом способе предпочтительно применя ется рН ниже 5,0, так как 5 -экзонуклеаза в присутствии добавок (РНК и(МН) 504 ) стабильна в этих условиях,а фосфомоноэстераза, наоборот, инактивируется тем сильнее, чем ниже рНlФосфомоноэстеразы 5 -экзонуклеазы 16 45,7 49,5 65,5 6,0 38,5 5,5 38,5 5,0154,7 37 Из данных таблицы видно, что прогревание ферментного раствора при20 рН 4,7 приводит к инактивации фосфомоноэстеразы на 91, а 5 -экзонуклеазы всего на 37,сДальнейшая очистка 5 -экзонуклеазыот остаточной Фосфомоноэстеразы достигается осаждением органическим растворителем. Фракция,осаждаемая 0,5 объе-мом ацетона, содержит всю фосфомоно-эстеразную активность и лишь 5-105-экзонуклеазы. Вторая фракция,осаждаемая после дополнительного введениядвух объемов ацетона, содержит 5 -экзонуклеазу, свободную от примесей фос 9 фомоноэстеразы.П р и м е р . Выращивают Ас 1, соесоо г штамм Ав Ферменте ре емкостью1 мпри 30 С в течение 48 ч на питательной среде, содержащей пшеничнуюмуку, обработанную 3.-амилазой, осахаренный крахмал, и соли. Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильт 4 О рованием на фильтрперлите, Фермент содержится в фильтрате. К фильтру добавляют ИдС до конечной концентрации 510м и 2 М НС до рН 5,5.Раствор охлаждают до 4 С и к нему до"бавляют 2,5 объема охлажденного до4 С ацетона. Выпавший осадок через15 мин отделяют сепарированием (4 000об/мин) и высушивают в вакууме. Соотношение 5 -экзонуклеазной и фосфомоноэстеразной активности составляет90. Выход препарата 8,7 г/л культуральной, жидкости.10 г этого препарата растворяют в200 мл 0,005 И трис -НС буфера рН6,65, содержащего 1 10М ИдС(у .Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием 3000 об/мин и отбра"сывают. К 180 мл раствора добавляют1,8 г РНК, перемешивают до полногорастворения, добавляют еще 10,25 гЩ (ЙН)50+, рН раствора смещается дозначения 4,7 за счет РНК. Полученнуюсмесь (180 мл) нагревают до 60 С втечение 1 ч, охлаждают до 4 С и добавляют 90 мл ацетона (0,5 объема),охлажденного до 4 С. Через 30 мин825540 Составитель О,СкородумоваРедактор Н.Кузнецова Техред Н. Граб Корректор М.Демчик Заказ 2559/81 Тираж 397 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж; Раушская наб., д. 4/5Подписное Филиал ППП "Патентф, г. Ужгород,.ул. Проектная, 4 отделяют выпавший осадок центрифугированием, а к раствору повторно добавляют ацетон (4 С) в количестве 380 мл (2 объема). Впавший второй осадок, содержащий 5 -экзонуклеазу, собирают в вакуумах центрифугированием (3000 об/мин) и высушивают в5 вакууме. Выход составляет 4 г и 47 по ферментативной активности.от неочищенного препарата, Фосфомоноэстеразная активность не обнаруживается при увеличении концентрации фермента в 10 раз и времени инкубации с субстратом в 4 раза. Из продуктов гидро- лиза РНК методом тонкослойной хроматографии обнаружены только нуклеотиды. 15Таким образбм предлагаемый способ/очистки 5 -экзонуклеазы позволяет получать 5-экзонуклеазу, синтезируемую Асс. сое 11 со 1 ог, не содержащую примесей фосфомоноэстеразы, 5 -экзо О нуклеаза может найти применение в пищевой промышленности и медицине для получения нуклеотидов из нуклеиновых кислот.В отличие от известного способа предлагаемый способ легко может бить реализован в условиях завода. Формула изобретения1, Способ очистки 5 -экзонуклеазы/Асй 1 поаусеь сое 11 со 1 ог от фосфомоноэстеразы, включающий прогрев фермент- ного раствора в присутствии стабилизирующих добавок в течение 40-90 мини фракционирование, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качестваполучаемого продукта, прогрев осуществляют при рН 4,7-5,0, при 45-50 С,в качестве стабилизирующих добавокиспользуют сульфат аммония и рибонуклеиновую кислоту, а фракционированиеосуществляют ацетоном в две стадии,соответственно 0,5 и 2,0 объемами поотношению к объему исходного раствора с отделением после первой стадииосадка фосфомоноэстеразы,2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что исгользуют 5 -экзонуклеазу Асс 1 поаусе сое 11 со 1 огшт. А.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве исходного используют 4-6-ный раствор фермента в 0,005 М трио-НС 1 буфере, содержащем 10 М МдС 1,-24. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с.я тем, что сульфат аммонияиспользуют в количестве 8-11 Ъ от насыщения, а рибонуклеиновую кислотув количестве 0,9-1,0 Ъ. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Львова Т.Н., Артамонова О.И.,Татарская Р.И. Метод получения препарата экзонуклеазы А, свободного отпримесей фосфомоноэстераз. Вып. 4.