Способ получения рибонуклеазы

Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 270379 (21) 2742091/28-13 (51)М. КЛ. С 12 Э 13/10 с присоединением заявки Мо Государственный комитет СССР по делам изобретений н открытийОпубликовано 2301.81. бюллетень М 3 Дата опубликования описания 230 181(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗЫ Изобретение относится к микробио-. логической промышленности, а именно к способу получения рибонуклеазы.Известен способ получения рибонуклеазы, предусматривающий культивирование ее продуцента в . бактерий вида Вас 1 сснз ьоЫЖз на питательной среде, содержащей источники азота, фосфора,. минеральные соли и крахмал в качестве источника углерода 113Недостатками известного способа являются низкая активность фермента и большая продолжительность процесса культивирования.Цель изобретения - повышение ак тивности фермента и сокращение време. ни культивирования.Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента рибонуклеазы иэ вида Вос 1 Ицв воЬМВИ ис пользуют штамм Вос 1 Иов эцМ 16 тв ЦМПМ В - 1611. При этом культивирование продуцента осуществляют на пита тельной среде следующего состава, г/л: 25Крахмал картофельныйосахаренный 100-140Гидролнэат микробнойбиомассы 13-17КС 8 или Кх 50 а 0,27-0,33 ъ 9 О 4 0,009-0,011Вода . Остальное.Штамм оас 1 Р Сов эоЪО 11 ъ ЦМПМ В1611 хранится в коллекции культурВНИИ генетики и селекции, промышленныхмикроорганизмов.Характеристика штамма.Культурально-морфологические признаки. На сусло"мясо-пептонном агаре колонии довольно крупные, до 15 мм в диаметре, сухие,кожистые,морщинистые, края колоний сильно изрезаны, поверхность колонии покрыта серовато" белым налетом, в агар колонии не врастают. На картофельном агаре пленка культуры тоньше и сильно врастает в агар. На ломтиках картофеля культура образует мощную пленку серого цвета, сильно складчатую. Выделяет значительное количество бурого пигмеи та, в ломти картофеля врастает слабо. Пузырьков со слизью нет. На пшеничных отрубях культура дает очень богатый рост в виде шаровидных серовато-белых скоплений по всей толщине среды, На глюкозном агаре культура растет по всему уколу с образованием газа.Клетки поверхностной культуры соединены в длинные Филаменты, при глу-.бинном культивировании встречаютсякак одиночные клетки, так и соединенные попарно или по четыре. Размерклеток; диаметр 0,6-0,7 рдлина 1,5-35 лс . Диаметр спор не превышает диаметра клетки, споры расположены эксцентрально, но ближе к центру, чемрезко отличаются от спор многих других штаммов того же вида, имеющих видспичечной головки.физиолого-биохимические свойства.Молоко пептонизирует без подкисления. Желатину разжижает. Казеин икрахмал гидролизует.Отношение к углеводам: арабинозу, 5галактозу, клюкоэу, ксилозу,рамнозу,дульцит, маннит, сорбит, мальтоэу,лактозу, сахароэу, декстрины, крахмал ассимилирует без предпочтения.Нитраты восстанавливает, 20На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол.Хорошо растет при 25-42 С, оптимальная температура роста 37 С,Культура является аэробом, в отсутствии кислорода подвергаетсяанаэробному лизису.При глубинном культивировании напитательных средах, содержащих органические источники углерода, азотаи минеральные соли, штамм синтеэи- ЗОрует следующие Ферменты: комплексбактериолитических ферментов,глюканазу, маннаназу, хитинаэу, нейтральную протеазу, РНКазу, сС-амилазу,каталаэу.35П р и м е р 1. 120 г картофельного крахмала,суспендируют в 500 млводопроводной воды, добавляют 0,2 гамилосубтидина ГЗХ и нагревают взвесьпри постоянном перемешивании до 80 С, Опериодически проверяя реакцию крахмала с йодом. Осахаривание заканчивают по достижении красно-коричневойокраски.В 500 мл водопроводной воды растворяют 0,3 г калия сернокислого и0,01 г сернокислого цинка, добавляют 15 г сухого ферментативного гидролизата биомассы метанокисляющихбактерий лтщательно размешивают полу- Яченную взвесь, затем добавляют раствор осахаренного крахмала, вновьперемешивают среду и устанавливаютрН 6,8 с помощью 10 раствора ЮаОН.Питательную среду разливают по 100 млв колбы емкостью 750 мл и стерилизуют в течение часа при давлении 0,5 ат,После охлаждения среду засеваютводной суспензией поверхностной культуры В. 5 ОЖЮ 1 з В, выращеннойна ломтях картофеля в течение суток 6 Опри 37 С,Колбы с засеянной средой инкубируют на качалке при 37 С в течение 20 чПо окончании инкубации рН культуральной жидкости 4,6 активность рН 65 Казы 5200 ед/мл. Активность фермента сохранялась в течение 10 дней при хранении культуральной жидкости при температуре 5 С.П р и м е р 2 В чан,оборудован ный мешалкой и водяной рубашкой, наливают 75 л водопроводной воды и при перемешивании добавляют 18 кг картофельного крахмала и 60 г амилосубтилина ГЗХ. Суспензию крахмала нагревают при перемешивании до 75 С и выдерживают при этой температуре 10 мин до момента перехода крахмала в эритродекстрины. Раствор осахаренного крахмала передают в Ферментер емкостью 250 мл вносят 0,2 л подсолнечного масла в качестве пеногасителя и стерилиэуют компонент 30 глин при 135 С.В чан с мешалкой наливают 45 л во допроводной воды, вносят 2 кг сухого Ферментативного гидролизата БВК, 0,045 кг КС 8 и 0,0015 кг сернокислого цинка, тщательно размешивают взвесь и передают в сателлит ферментера. (Стерилиэуют 30 мин при 135 С.После охлаждения до 60 С содержимое сателлита передают в Ферментер, среду охлаждают до температяы 40 С, устанавливают рН 7 с помощью водного аммиака.Питательную среду засеваМи воднойсуспензией культуры о.ьоООБ 6 В,выращенной в колбе на пшеничных отру.бях в течение 2 сут при 37 С,Выращивание в ферментере проводятпри 371 ОС, постоянном перемешиваниии аэрации 8-10 м /ч, продолжительность выращивания 18 ч. В процессевыращивания рН культуральной жидкости не регулируют. По окончании процесса рН культуральной жидкости составляет 4,3, активность рН Казы6800 ед/мл, объем культуральной жидкости 150 л. Активность рН Казы вкультуральной жидкости оставаласьпостоянной в течение 7 дней при 5"10 ОС,Предлагаемый способ получения рибонуклеазы позволяет увеличить активностьФфермента в культуральной жидкостидо 5200-6800 ед/мл, что в 3 раза выше по,сравнению с известным способомпри одновременном сокращении продолжительности выращивания продуцента.формула изобретения1, Способ получения рибонуклеазы., предусматривающий культивирование ее продуцента - бактерий вида В а с1 ц э 5 ОЪОВЪ на питательной среде, содержащей источники азота, Фосфора, минеральные соли и крахмал в качестве источника углерода, о т л и ч а ю-щ и й с я тем,что,с целью повышения активности фермента и сокращения вре. мени культивирования,в качестве продуцента рибонуклеазы. иэ вида ВОСВ798165 Составитель Т. МелентьеваРедактор Т.Киселева Техред Т, Яаточка Корректор М,немчик Подписное Закаэ 9949/30, Тираж 539ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам иэобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП фПатент. г. Ужжвод, ул, Проектная, 4 Ьэ вцо 1 Ю 1 з испольэуют штамм Вас 16- Р,цв цэлР 1 ь ЦМПМ В.2, Способ по и, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что культивирование продуцента осуществляют на питательной среде следующего состава, г/л:Крахмал картофельныйосахаренный 100-140 Гидролизат микробной биомассы 13-17КСЯ или К 60 О, 27-0, 33Хи 504 0,009-0,011Вода ОстальноеИсточники информации,5 принятые во внимание при экспертиэе1.%511 ВОГа ь. ВаС 1 ИбВ ВцЪОС 1 Э 1 ЪОпцсеае "Ргосеейпо в 1 п посСе 1 с ас 1 д ге.ьеагсИ" йечч тогк- ьопдоп, 496 ь. 56-6 ъ.