Способ получения поверхностных растворимых антигенов микробов кишечной группы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 021178 (21)2680553/28-13 (51) М Кл с присоединением заявки Мо(23) Приоритет -А 61 К 39/108 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 23.12.80, Бюллетень Мо 474 Дата опубликования описания 23. 12. 80(11) Заявите 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ РАСТВОРИ АНТИГЕНОВ МИКРОБОВ КИШЕЧНОЙ ГРУППЫ 2пробе на морских свинках УД не более 5 млн) сеют на твердую питательную среду (казеиновый.агар или агар на мясном Хоттингере) рН 7,4- 7,6, через 18-20 ч отбирают колонии 1 фазы и сеют на мясной (по Хоттингеру ) бульон рН 7,4 - 7,6 на 3-4 ч, затем бульонную культуру засе. вают на матрицы с агаром на мясном Хоттингере рН 7,4-7,6. После выращивания при 37 С в течение 18-20 ч, микробы смывают забуференным 0,85раствором хлорида натрия рН 7,2.Взвесь промывают тем же раствором с помощью центрифугирования при 4- 6 оС 5-6 тыс об/мин в течение часа. Микробный осадок суспендируют в охлажденном забуференном 0,85 растворе хлорида натрияК 1 объему взвеси отмытых микробов добавляют тонкой струей при постоянном помешивании 2 объема ацетона. Взвесь оставляют на 2-3 ч, перемешивая первые 1,5 ч на шуттель-аппарате при 120 об/мин. Затем ацетон декантируют и добавляют свежий ацетон в объеме, равном двойному объему осадка микробов. После непрерывного взбалтывания в течение 30 мин взвесь оставляют при комнатной температуре н; Спосоразом.На 1су шигелЛиофибов Зонн мас ают микробную зы.культуру микрорулентность в ККапе получ Зонне 1 ф зированну 1 фазы (в Изобретение относится к медицине, а именно прикладной иьжунологии.Известен способ получения поверхностных растворимых антигенов микробов кишечной группы путем экстрак ции высушенной биомассы раствором хлористого натрия, отделения экстракта центрифугированием с последующим его диализом и выделением целевого продукта 111. ООднако известный способ не позволяет выделить протективной фракции 5 сЬ 19 е 11 а Хоппе.Цель изобретения - выделение протективной фракции Все 9 е 11 а Хоппе. 15Эта цель достигается тем,что отО деление экстракта ведут при 4-6 С, диализуют против 0,15-ного раствора хлористого натрия, полученный диализат центрифугируют при 4-6 С 2 О и из полученной надосадочной жидкости выделяют целевой продукт с мол. вес, 1,6-2 мпн дальтон фракционированием на ультрагеле.б осуществляют следующим об 1 ский институт эпидеМиологий789114 ра МаС 1. Диализат центрифугируют притех же условиях.; На 3 этапе получают высокомолекулярную Фракцию. Для этого свежеприготовленный экстракт наносят на колонку с ультрагелем АСА, в качестве элюирующего раствора 0,15 МаС.Высокомолекулярная фракция представляет 1 пик, который собирают и высушивают лиофильно без последующегоподогрева. Молекулярный вес полученной фракции 1,6-2 млн. дальтон,Выход антигенного комплекса поотношению к исходному весу сухой биомассы 3,2-3,9.15Оптимальные, минимальные и максимальные показатели режима при получении протективной фракции микробовЗонне представлены в табл.20 При изменении параметров режима,как в сторону уменьшения, так и всторону увеличения, свойства протективной фракции,ее растворимость, аследовательно, возможность использо вания для иммунизации, снижается.Предлагаемый способ позволяетвыделить протективную фракцию 5 сЬ е 1)а Еоппе. Этапы получения протективной Фракции Свойства протективной фракции Показатели Получение высокомолекулярнойфракции Раство- римость Получение солевого экстрактаповерхностныхрастворимыхантигенов Иммуногенные свойства наморскихсвинках Исходная КРат- культура нос-ь Е Фазы, обраф боткиаце- тоном Дли- Диализ тель- в расность ,творе Обработкиацето ном,сут Центри- Фугирование и диализ притемпературе, фС Элюирующий раствор,Минимальные 70 0,05 Полная 0,05 Оптимальные 0,1 Ь То же 0,15 5 4 100 Максимальные 0,58 0,58 7 7 100 15-16 ч, после чего вновь проводят смену ацетона. Ацетон меняют 5 раз на протяжении 4-х дней, после чего декантируют, а осадок переливают в широкую емкостьдля высушивания на 2-3 дня. Получают легко рассыпающийся порошок белого или желтоватого цвета.Оптимальными условиями на этом этапе являются: использование культуры с показателем 1 фазы не менее 90; 5 кратная" смена ацетойа в течение 4 дней,На 2 этапе получают солевой экстракт поверхностных растворимых антигенов шигелл Зонне.На 10 г сухих микробов добавляют 100 мл забуференного 0,85 раствора хлорида натрия рН 7,.2, тщательно размешивают до получения однородной массы и ставят на один час на шуттель-аппарат при 4-6 ОС при 240 колебаний в минуту. Взвесь центрифугируют при 4-6 ОС 12 тыс об/мин в течение 20 мин, надосадок декантируют и повторно центрифугируют при тех же условиях и затем диализируют против 0,15 раствора хлорида натрия при 4-6 фС в течение 24-48 ч при 3-4 разовой смене свежего раствоПолучение микробноймассы шигелл Зонне1 Фазы1 Превышает иммуноген ные свойства антигена Буаве.на, примененного в оптимальных дозах и приближается к защитной активности живой стрептоми- цинзависимой культу- ры789114 формула изобретения Составитель С.МалютинаРедактор С.Патрушева Техрег, М.Рейвес Корректор Е.Папп 8920/3 Тираж 673 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035,Москва,Ж,Раушская наб.,д.4/5Заказ филиал ППП "Патентф,г.ужгород,ул.Проектная,4Способ получения поверхностных растворимых антигенов микробов кишечной группы путем экстракции высушенной биомассы раствором хлористого натрия, отделения экстракта центрифугированием с последующим его диализом и выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью выделения протективной фракции 5 сЬ 1 де 11 а Еоппе, отделение экстракта ведут при 4-6 фС, диализуют против 0,15-ного соленого раствора хлористого натрия, полученный диализат центрифугируют при 4-6 С и из полученной насадочной жидкости выделяют целевой продукт с мол.вес 1,6- 2 мпн, дальтон фракционированием на.ультрагеле.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Руководство по .вакцинному и О сывороточному делу, Под ред. П,Н.Б 31 ргасова, М., 1978, с. 50-53.