Способ приготовления тест-системы для оценки противовирусных конъюгатов

оп 700110 Союз СоветскнхСоцнвлнстнческнхРеспублик ОП ИИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУрио ет бли ковано 30.11.7 юллетеиь ЭЙ 44(088 8) исакия 30.11.79 ата опубликоваии Авторы обретен А, Журов, Б, М, Лялток и 10. И. Вас вердловский научно-исследовательский ннст вирусных инфекций(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТ - СИСТЕМЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ КОНЬЮГАТОВ Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при экспресс-диагностике вирусных заболеваний.Известен способ приготовления тест-системь для оценки противовирусных коныогатов путем присоединения к стабилизированным эрит- роцитам антигена 111.Однако известный способ не позволяет получить высокоактивные и специфичные тест- системы, так как используемые химические посредники не способны избирательно реагировать как с вирусными, так и с клеточными антигенами,Целью изобретения является увеличение на поверхности эритроцнтов числа рецепторов, способных избирательно соединяться со специфическими вирусными или клеточными антигегированного гамма-глобу енную тест-систему стаб о 0,001 - 0,005%-ную анных эритроцитов обагрегированнымцифическим гамма 0,005 - 0,05%, заичный к активным нами.Эта цель достигается тем, чтсуспензию стабилизироврабатывают предварительноглутаровым альдегидом спеглобулнном в концентрациитем присоединяют гомолог центрам антител агрелина антиген и получ илиэируют,Способ осуществляют следующим образом,Эритроциты 0 группы крови человека, от 5чмытые от отрицательной реакции надосадочнонжидкости с 50%-ной четыреххлоруксусной кислотой стабилизируют глутаровым альдегидомв конечной концентрации 0,25% при нейтральной рН и температуре 37 С в течение 3 ч.0Выделяют иммуноглобулиновую фракциюиз сыворотки крови кролика (с титром поРТГА не менее чем 1:320 к вирусу гриппаАили В) методом осаждения сернокислымаммонием в концентрации 37,5% от насыщеч 15ного раствора в течение 6 ч при температуре4 С с освобождением от соли методом гельфильтрации на сефадексе 6 - 25,К 5 мл гамма-глобулина кролика, раэведен 26ного забуференным физиологическим раство.ром с рН 7,2 до концентрации белка 0,005 -0,05%, добавляют 0,3 мл 2,5 о-ного глутарово.ого альдегида и агрегируют при 37 С в течение 1 ч, после чего добавляют 0,1 - 0,2 мл0,5%-ных глутаризировацных эритроцитов ч:ло. века и присоединяют к цим агрегированный гамма-глобулиц при температуре 56 С В течение 90 миц и встряхивании через каждье 15 - 20 мин, После освобождения от крупных агрегатов декантацией и отмывки В физиологическом растворе нагруженные специфическим гамма.глобулином эритроциты выдерживаю г 417 ч цри 4 - 25 С в апапоисной Вируссодержацей жидкости: к 1 - 10 мл аллацтоисцой Вируссодержащей жидкости с титром по РГА1%-ными куриными эритроцитами от 1:16 ро 1:2048 добавляют 10 - 10 эритрощгтоа,Результаты оценки иммунофлуоресцентной ИФ.активности флуоресцнрующих антител, спе цифичных к гриппу А, и В, представлены на графике (сь. чертеж), где: на оси абсцисс степень нагрузки в вибрионах на 1 зритроци па оси ордиат - ИФ-активность, выраженная ВеэВчинами ооратными использованным разве- О дсциям коньагатов; кривая А показывает зависимость специфической ИФ-активности флуореспирующих антител ФА) к гриппу А эт степени нагрузки эритроцитов вирусом грип. па А; кривая Бзависимость спецфичес- кой ИФ-активности ФА к гриппу В от сгепец нагрузки эритроцитов Вирусом гриппа В; кривая В . - зависимость перекрестной ИФ-активности ФА к гриппу А, от степени нагруз.г кц эритроцптов Вирусом гритша В; кривая Г= зп зависимость перекрестной ИФ-активности ФА к гриппу В от степени нагрузки эритроцитов Вирусом гриппа Аэ. Из представленных; данных видно, что . ИФ-активность противогриппозных конъюгатов :. - .глодигса в прямой зависимости от количест. ва вибрионов в использованной тест-системе.Максимальное количество вируса, присоедиз ценное к эрптроцитам с помощью предлагаемого способа, составляет для гриппа В 2 - -1 тысячидля гриппа А 2 8 - 16 тысяч Вибрионов на 1 эритроцит (теоретически Возможная нагрузка эритроцитов, при условии расположения вибрионов в один слой, в пределах 5- 20 тысяч вибрионов ца 1 эритроцит), Благодаря испОльзованию тест-системы с болыцимколичеством вируса удается выявить даже цезначительцуо перекрестнуто активность оцени.Ваемых коцъюгатов. С помощью полученных тест.Врелзратон ь 10 жцо ать достаточно полную характеристик иэучаемьм коцъюгатам, кото рая Включает В себя: чувствительность и перекрестную активность иммуцофлуоресцецтцых рЕаКцнй В ЗаВИСИМОСтИ От ВэятОГО рабОЛЕГО разведения конъюгата, титры специфической и, песцецфической ИФ-активности оцениваемых конъюгатов.Предлагаемый способ позволяет получить достатогцый набор специфичных и с пеобходи мым количеством присОединенного ацтигена лиофилизированных тест-систем, пригодных для оценки красящей актТвцости, специфичности, и выбора Оптимального рабочего разведения противовирусных конъюгатов не только в процессе их производства., но и в конкретных условиях работы вирусологических лабораторий 1 оптические системы люмицесцентных микроскопов, светофильтры, источники ультрафиолетового света). Приготовление тест-систем уп. ростит ц ускорит конВоль конъюгатов. ПОВН- сит эффективность экспресс-диагностики вирусных заболеваний.Формула изобретенияСпособ триОтовлеция тест-системы для Оцен. к 1, 3 ротивовирусных коцъюгатОВ путем лрисоедлеця к стаби:тизировццым эритроцитам ан. тигецзотличаюцийся тем,что, с целью увеличения на зовсрхцости эритроци. ТОВ гцСЛа рсцЕПТОрОВ, СПОСОбНЫХ ИэбцратЕЛЬНО соединяться со специфическими вирусными или клеточными антигенами, 0,001 - 0.005,ь -цую суспецэиО стабилцзироващых эритроцитов обрабатываОт предварптелыо агрегированным глутаровьц альдег 1 дом специфическим гаммаглобулином а коцценрации 0,005 - 0,05%, затем присоединяю гомологичцый к активным центрам ацтчтсл агрегированного гамма-глобулина антигец и полученную тест-систему стабилизируют.Источники ицворыации,принятые во внимание при экспертизе1. Пагава И. И. Оценка иммуцофлуоресцентцой активности ФА и иммунных сыворотокропВ возбудителей ОРЗ с помощью эритроцигарных тест-объектов, Кцц. дис. Л., 1972,Заказ 7282/3 Подписноитета СССРьпийнаб., д. 4/5 сударственного ком изобретений и откр а, Ж - 35, Раушская ПП "Патент", г, Ужгород, ул, Прое Фил дактор Н. Хубларова Тираж ЦНИИПИ Глодел 3035, Мое