Способ получения иммобилизованных никотинамидадениндинуклеотид (над)-зависимых ферментов

61) Дополнительное к авт, св22) Заявлено 22.12.75 (21) 23 23-04 7 ГО присоединением заявки М Гасударствоииьй иомао Воовтв Неаотроа СИ оо дезам кзобротоной и открытом(46) Дата опубликования описания 2006,7, Горяев и Ю, А, Шацовапов 7 Ц Заявитель Ордена Трудового Красного Знамени химических наук АН Казахской ССР титут 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАН НИ КОТИН А МИРИАДЕ Н И НДИ Н УКЛЕОТИ Д (НАИ) ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ Изобретение относится к способам по- лучения им мобилизованных ферментов, которые имеют большие перспективы дпя испокьзования их в химической промышленности дпя получения продуктов ферментативных реакций.Известно большое число способов получения иммобилиэыванных ферментов на твердых носителях органической и неорганической природы, адсорбированыых на пористом стекпе, целлюлозе, .ианообменной целлюлозе, а также на синтетических ионообменных смопах. Одним иэ недостатков известных методов иммобикиэации фермеытов является ограниченный спектр используемых ферментов, Это объясняется напичием значительного ко пичества ферментов, которые требуют дпя проявпения ферментативной актывиос ти участия ннзкомолекупярных коферментов, Поэтому для проявкении такими ферментами активности в иммобипизовацном состоянии в гетерогенной системе должен присутствовать растворенный коермент С другой стороны, проведение треб мепроцессов в непрерывном режиме увтрасхода бопьщого количества кофер нтов, которые очень дороги, и, в отпичие от самого фремента, участвуют топько. в одном цикле реакции Я,Известен способ получения иммобипизованных никотииамидадениндинукпеотид(НАД)-зависимых ферментов, вкпючающий свяэьеание кофермента НАИ в окис- О пенной ипн восстановпенной форме сносителем, связывание фермента с присоединенным к носитепю коферментомНАД, Способ осыован на ковапентномсвяэьеании кофермента и фермента с 1 Б носителем при помощи реакции аиазосочетаыия, Способ включает несколькостадий; поаучение амиыопроизводного иоситепя, диаэотироваиие аминированногоносителя, связывание кофермэнта с диаэо производным носителя и присоединениефермента к коферменту на иоситепе. Процесс длится более суток Я .Иекью настоящего изобретения явпся укрощение процесса попучения иммо- Б бипизоваиных НАО-зависимых ферментов яет О П И С А Н И Е оае 1 вов 7ИЗОБРЕТЕ Н ЙЯ.Поставленная цепь достигается тем,что при получении иммобидизованных НАДзависимых ферментов, связывание НАД,сносытедем осушествдапот путем сорбции, фВ качестве носителя используется целдюдозаи ее производные. В качестве НАД-зависимого фермента используют адкогольдегидрогениэу, И качестве производных целлюлозыисподьэукт щанидоэтилцеллюдозу. ОСущность изобретения заключается всорбцин на носителе кофермента НАЙ(в окидпенной ипи востацовденной фор- :ме) с последующим присоедднением фермента к слою сорбированного кофермента, фПредпочтительно процесс проводятспедукхдим образом, Производят сорбциюкофермента (НАД иди НАДф Н )на сорбентах,обеспечивающйх прочнбе. связывание кофермента с последующим связыванием фферментов со слоем сорбнрованного кафермента эа счет специфического взаимодействия фермент-кофермент, а такжевзаимодействия фермента с носителем.Вия замены инактивированных в про 25цессе работы фермента и коферментана новые предлагается осуществлять ихдесорбцию в условиях, отличных от условий в которых работает система ферменттЭОкофер мент,Описькаемый способ испытан всистеме ал.когольдегидрогеназа-никотииамидаденнннук"леотид (НАД). Для этого кофермент НАДсорбнруют, например, на целлюлозе иэ3%водного О,О 15 М буферного растворафосфата калия при рН 7,7 и вводят всистему фермент - алкогольдегидрогеназу. При этом происходит фсамосборкафим мОбилизойаяиой фермжзт кофермянтной 4системы - целлюлоза-НАД-алкогольдегидрогеназа, которая в условиях проведенияферментативного дроаееса восстановления лактапьдегида в 1,2-пропандиоп(0,015 М буферный раствоо фосфатакалия при рН 7,7, температура 37 С)прочно удерживается на еорбенте. В случае потери активности ферменткоферментной системы проводится ее де- бо сорбция непосредственно в ферментатив-ном реакторе (напрнмер, проточной колонке) водно-спиртовой смесью 3:.1при рНс последующей: иммобидизацней активных компонент по описывае- и мому способу,П р н м е р 1. Из исходного раствора восстановленного никотинамидаденин дикчклеотипв 1 НАЛ НЪ. кпппаич одлиаб фосфата калия рН 7,7 берут апмквоту, додержащую примерно 26010 НАД Н й в 2 мп буферного раствора (койьестао взятого ддя србции НАЙфН проверяют спектрофотометрическнм методом при 340 ммк в 1 см кювете, учитывая, что коэффициент;" светопогааения; ддя НАЗмлмамНй / Е 6,2)рПриготрвденный раствор кофермейта приливают к 0,1 г гуанидоэтидцеддюдоэы. Сарбцию кофермента проводят.в течение 1 ч при 5 С и пернодическом перемещивании. После сорбции целлюлозу отдвдяют от раствора и последний спектрофотометрируют. По разности исходнйх и конечных количеств НАЙ ф Н определяют вепичкну сорбции. Йпя гуанидоэтидцеддюдоэы она соответствует 89,6%. Слабо связанный с сорбецтом НАЛф Н., отмывают буфер, ным раствором.Количественное определение иммобипиэованного на гуанидоэтнпцеппюпозе , НАД Н осуществляютпо нингидрин-сер, нокисдотной методике. Ипя этого готовят раствор, содержащий следующие компоненты; 0,1 б ымоль/мд буфера фосфата калия (рН 7,7)50 мкмодь/мд этанопа, 17 мкмопь/мд пактадьдегнда н О, 16 мг/мд апкогодьдегидрогеназы (все компоненты реакционной смеси добавляют прн 0 С),0,2 мп подученной смеси приливают в пробирки со.стандартными растворами, содержащими известное количество НАДН и с 0,1 г целлюлозы с сорбированным НАЦ К . Реакционные смеси ннкубируют в термостате прнр37 С в течение 45 мин, После чего фер ментативную реакцию в стандартных растворах прекращают добавлением 1 мп серной кислоты. В случае, иммобилнзованной системы реакция останавливается отделением раствора. субстрата от иммобипизованной фермен коферментной снотемы фильТрованием в центрифуге, Ддя стандартизации условий,в фипьтрат добавляют 1 мп серной кислоты. Растворы тщательно перемещивают и снова инкурбируют прн 70 С в течение 10 мин, Реакционную сми:ь охдаждают до комнатной температуры и при тщательном перемешиванин добавляют 40 мкп свежеприготовленного раствора нингндрина (3% нкнгидрина к 8% бнсудьфкта натрия), Раствор оставляют стоять при комнатной температуре в течение 60 мин затем в смесь приливают еще 1 мд концентрированной серной кислоты и оотавдяют стоять при комнатной температуре в течение Я мии. Оптицеекчм плот