Способ иммобилизации ферментов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 950771 Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(22) Заявлено 05. 10. 79 (21) 2849850/28-13с присоединением заявки Мо -(23) Приоритет -Опубликовано 150882. Бюллетень Мо 30Дата опубликования описания 15. 08. 82 51 М. Кп.з С 12 И 11/14 Государственнык комитет СССР по делам изобретении и открытии(53 УДК 577,15. .07(088,8) Н, Б. Шйтова, Г, А. Коваленко, Л, В, Д. Соколовский и Э. А. Леви 72) зобретения ого Красного Знамени ирского отделения АН дена Т 71) Заявите(5 4) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТО змеру глобу транспорт с ции.вляется пов илизованных процесса за дешевых и д м м и Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, получению гетерогенных катализаторов на неорганических матрицах,Известен способ иммобилизации Ферментов, в частности, щелочной фосфатазы, адсорбцией на карбохооме из нейтральных и щелочных буферных растворов 1. Используемый в качестве носителя карбохром представляет собой термическую сажу с нанесенным на ее поверхность пироуглеродом при пиролизе бензола (фракция с размером гранул 0,25-0,5 мм).Однако данный способ не обеспечивает высокой активности получаемых иммобилизованных ферментов, достигаемая активность не превышает 5-20 от исходной активности фермента в растворе. Кроме того, использование укаэанного носителя требует дополнительных затрат на его получение, при этом для данного носителя ограничены возможности регулирования макрокинетических свойств матрицы, прежде всего пористой структуры. Эта характеоистика является чрезвычайно важно для иммобилизации Фермента, так как для получения стабильного и активного препарата размер пор носителя дол жен соответствовать рафермента и обеспечить убстрата и продукта реак5 Целью изобретения я ыше ние активности иммобферментов и упрощениесчет применения более оступных носителей.Укаэанная цель достигается тем,что при осуществлении способа иммобилизации ферментов, адсорбцией науглеродсодержащих носителях в качестве носителей используют окись алюминия или окись кремния, или алюмосиликаты, эауглероженные при пиролизеуглеводородов.Минеоальные матрицы, зауглероженные в различных каталитических реакциях пиролиэа углеводородов, Фактически поедставляют собой отоаботанные катализаторы ояда нефтехимических производств. При этом используемые минеральные матрицы являютсядешевыми и широко распространенныминосителями с легко регулируемымиакрокинетическими характеристикаи (пористая структура, площадьоверхности 1. Нанесенное на минеральный каркас углеродное покрытие обуславливает более прочное связываниефермента с носителем за счет связывания фермента с обеими составляющими носителя (как с минеральной матрицей, так и с углеродным покрытием).Активность иммобилиэованных ферментов, полученных предлагаемым спо собом, составляет 20-50.Носители, используемые в предлага-, емом способе, получают следующим образом.В кварцевый реактор (100 см ) по О мешают 50 смЭ исходной окиси алюминия или окиси кремния, или алюмоси ликата, приводят слой в виброожиженное состояние, опускают реактор в трубчатую печь и до выхода на заданную температуру (6500 С) пропускают ток аргона (10 л/ч) для удаления следов влаги. Эатем образец зауглероживают, обрабатывая его дивинилом или пропан-бутаном, или бензолом, или толуолом в течение часа. По окончании процесса реактор продувают 30 мин аргоном, после чего охлаждают также в токе аргона. В полученном углерод- содержащем сорбенте определяют содержание углерода весовым методом и удельную поверхность по тепловой десорбции аргона.П р и м е р 1, Иммобилиэация лак-татдегидрогенаэы на окиси алюминиязауглероженной при пиролизе дивинила.Навеску А 310(100 мг), зауглероженного пиролизом дивинила согласноприведенной методике ( С = 16,5;Язр, = 89 мф/г; размер частиц 0,25- 350,40 мм) заливают 3-5 мл воды и дезаэрируют до прекращения выделенияпузырьков воздуха из пор адсорбента.Эта предосторожность позволяет избежать денатурации фермента на границе 40раздела жидкой и газообразной фаз,где ее скорость значительно выше,чем в растворе. Дезаэрированный носитель переносят в медленно вращающуюся колбу, .заливают 10 мл раствора 45лактатдегидрогеназы (концентрация0,4 мг/мл) в 0,05 М фосфатном буфере с рН = 6,0 и перемешивают в течение часа при 4 С. Слабо связанныйос носителем фермент удаляют трехкратным промыванием 1 М растворомхлористого натрияПо разности количеств фермента в исходном раствореи в растворе после нанесения, соединенном с промывными водами, рассчитывают количество адсорбированнойлактатдегидрогенаэы в миллиграммахФермента на грамм носителя, оно составляет 40 мг/г. Полученнйй препарат иммобилиэованной лактатдегидрогеназы заливают фосфатным буФером 60.и выдерживают в течение недели, Какпоказывают измерения активности раст"вора и общий анализ на белок, десорбции Фермента с поверхности носителяне .происходит. 65Носитель с адсорбированным на нем ферментом загружают в беэградиентный реактор циркуляционной установки, термостатированной при 25 С, и определяют активность иммобилизованной лактатдегидрогеназы по уменьшению оптической плотности никотинамидадениндинуклеотида (АРАОН) при длине волны 340 нм в реакции, ката 1 лиэируемой этим ферментомН.1СНССОО+ НЛЭН+И- - ф ЩСС 00+КАЭ10 ОН(ЛахааЛ 1) Скорость циркуляции выбирают такойчтобы скорость реакции от нее не зависела, что позволяет избежать протекания реакции во внутридиффузионнойобласти.Адсорбированная лактатдегидрогеназа сохраняет 35 активности от активности фермента в растворе. Адсорбция лактатдегидрогеназы на эауглероженном АРОэ повышает ее термостабильность. При нагревании при 650 Св течение 10 ч сохраняется 45 начальной активности адсорбированнойлактатдегидрогеназы, в то время какфермент в растворе при этой температуре полностью инактивируется за1-2 мин.Адсорбированный фермент значительно стабильнее при длительном хранении, чем фермент в растворе. Последний полностью деэактивируется в течение 1-2 недель в фосфатном буферес рН = 6,0 при комнатной температуре.Иммобилизованная же лактатдегидрогеназа сохраняет 90 активности от исходной величины в течение 6 мес притех же условиях,П р и м е р 2. Иммобилиэация лактатдегидрогенаэы на окиси алюминий,эауглероженной при пиролизе бензола.На АР,10, зауглероженный пиролизом бензола ( С = 3,4; Я д = 114 юг;размер частиц 0,25-0,40 мм), наносятФермент в количестве 30 мг/г по методике, описанной в примере 1.Адсорбированный Фермент сохраняет 30 активности от активности лактатдегидрогенаэы в растворе. Актив-.ность определяется также, как в примере 1. При хранении в течение 3 мес(фосфатный буФер с рН6,0 комнатная температура) активность иммобилиэованного фермента сохраняетсяна 100 в сравнении с исходной.П р и м е р 3. Иммобилизация лактатдегидрогеназы на окиси кремния,эауглероженной при пиролизе толуола.На ЫО, эауглероженный пироизомтолуола ( С 18,0 Яд,= бб м /г 1размер частиц 0,15-0,40 мм), наносят фермент по методике, отли950771 формула изобретения 1. Жирков Ю. А., Чухрай Е. С.,Полторак О. М. и др. Адсорбционнаяиммобилизация щелочной фосфатаэына карбохроме. Вест. Моск. ун-та.Сер. "Химия", 1978, т. 19, 1 2,с. 127-132. Составитель О. СкбродумоваРедактор О. Персиянцева Техред М.Надь Корректор С. Шекмар Заказ 5899/29 Тираж 505ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Подписное филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная,4 чающейся от методики примера 1 тем, что адсорбцию проводят при комнатной температуре, периодически помешивая раствор фермента над носителем в течение суток. Остальные операции те же, что и в методике примера 1. Количество адсорбированной лактатдегидрогеназы составляет 25 мг/г.Адсорбированная лактатдегидроге-. наза сохраняет 20 активности от ак тивности фермента в растворе (активность определяется так же, как в примере 1) . Адсорбция на эауглероженной окиси кремния повышает стабильность ,фермента при длительном хранении.Им мобилизованная лактатдегидрогенеэа сохраняет 100 активности в течение 3 мес при комнатной температуре и - рН = 60.П р и м е р 5. На А 110 Э, заугле роженный пиролизом дивинила ( С =5 Б = 80 м/г; размер частиц 0,4-0,6 мм) наносят щелочную Фосфатаэу из кишечника цыплят "йеапаГ) в количестве 10 мг/г по следующей 25 методике: 50 мг носителя заливают 4 ют раствора фермента рН = 7,5, адсорбцию проводят при комнатной температуре в течение 4-5 ч при периодическом помешивании. КоличЕство адсорбированного фермента определяют по уменьшению его активности в растворе над носителем. Адсорбция фермента прочная и практически необратимая, что показано многократным испытанием в буферном растворе с рН = 7,5 в течение 2 недель.Адсорбированная на зауглероженном АЗО щелочная Фосфатаэа сохраняет 50 активности от активности фермента в растворе. Активность фермента Определяется по скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата, Накопление продукта реакции п-нитрофенола регистрируется спектрофотометрически при длине волны 400 нм. 45Через 2 недели хранения в буфере с рН = 7,5 адсорбированная щелочная фосфатаза не потеряла своей первоначальной активности. П р и м е р 6: На зауглерожен". ную окись алюминия ( С = 24, Б =17 м/г, размер частиц 0,25-0,40 мм) наносят лактатдегидрогеназу по методике примера 3 в количестве 31 мг/г. Адсорбция практически необратима: при выдерживании в буферном растворе с рН = 6,0 в течение 2 сут фермент над носителем не обнаруживается.Адсорбированная на эауглероженной окиси алюминия лактатдегидрогенаэа сохраняет 40 активности от активности фермента в растворе.За неделю хранения в буферном растворе с рН = 6,0 адсорбированный фермент сохраняет .80 первоначальной активности,Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в значительном упрощении процесса, достигаемом за счет использования в качестве носителей отработан-. ных катализаторов ряда нефтехимических производств, в частности крекинга углеводородов, а также в повышении активности получаемых иммобилиэованных ферментов. Способ иммобилизации ферментов адсорбцией на углеродсодержащих носителях, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения активности иммобили зованных ферментов, в качестве носителей используют окись алкииния, или окись кремния, или алюмосиликаты, эауглероженные при пиролиэе углеводородов. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе