Способ иммобилизации ферментов

с е о о (1,-;.1," яО П И С А Н И Е (1 ц 536192ИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВНДИИЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(43) Опубликовано 25 1176 Билле С 07 С 7102 У А 61 К 37/48 осударстаенный номит Совета Министроа ССС оо делам изаоретенийи открытий(45) Дата опубликования описания 19,04,77 72) Авторы изобретени И. Крылова, Л, В. Козлов, В, К. Антонов, Б. С. Ганна, Б. Я, Датунашвили и Я, М. Павленко иоорганической химии им. М. М. Шемякинаый научно-исследовательский институт виноградаи виноделия "Магарач" Институти Всесо 71) Заявители ства(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕН орошка метал 100-200 мкм лического титана с раз приливают 50 мл дымяь нагревают при 100 оС в ерез стеклянный фильтр ером чащей азот ои кислоты, сме час, фильтруют ечени Изобретение касается получения препаратов иммобилизованных ферментов, которые могут найти широкое применение в пищевой, химической, микробиологической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике. Ферменты, закрепленные на сорбенте, имеющем высокую удельную массу, могут быть использованы в реакторах с "кипящим слоем". Сорбентом, подходящим для этой цели, может быть металл, если он инертен в используемых средах и разрешен к применению в соответствующих отраслях промышленности (пищевой, медицинской),Известно много способов иммобилизации ферментов на носителях, В частности, для иммобилизации ферментов в качестве носителя применяют порошок нержавеющей стали, активированной посредством покрытия окисью титана, образующейся при гидролизе четыреххлористого титана 11. Недостаток такого метода - непригодность данного сорбента для применения в ряде отраслей пищевой про. мышле нности.Предложен способ получения препаратов иммобилизованных ферментов, заключающийся в том, что в качестве носителя используют порошок металлического титана, активированного путем покрытия окисью титана. Такой носитель образует вмягких условиях комплексные соединения с сорбируемыми белками,Способ получения препаратов иммобилизованных ферментов включает две последовательныестадии, Иа первой стадии порошкообраэный титанобрабатываю дымящей азотной кислотой, что создает возможность для активирования носителя.Активация носителя осуществляется посрецствоми его обработки четыреххлористым титаном в воде.На второй стадии осуществляют сорбцию ферментана.подготовленном таким образом носителе.Предлагаемый способ может быть использовандля иммобилизации практически всех ферментов и15 других белков. Особый интерес представляет иммобилизация кислых протеиназ (в том числе лепсина),которые неустойчивы при нейтральных и щелочныхзначениях рИ и вследствие этого теряьзт активностьв условиях болыцинства методов иммобилизации.20 П р и м е р 1, Получение активированного сорбента,К 10 гп536192 гично примеру 2. Активность полученного препарата иммобилизованной протеиназы по гемоглобину 200 ед/г.П р и м е р 4. Иммобилизация протеиназы изАзрегц 1 нз ащапог 78 - 2.К 1 г активированного сорбента приливают5,мл 1%-ного раствора протеиназы из Азрегц 1 из аччапюг 1 в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,0. Смесь взбалтывают на механической качалке 1 час при И 1 4 С и 10 час при 20 С. Промывают препарат аналогично примеру 2. Активность полученного препарата иммобилизованной протеиназы 380 ед/г.П р и м е р 5, Иммобилизация пектиназы изАзрегр из ааааа во г .1 й К 1 г активированного сорбента приливают5 мл 0,25%-ного раствора пектиназы из Азрегц 11 оз авгагпог в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,6. Смесь взбалтывают на механической качалке 2 часа при 4 С и 12 час при 20 С, Промывают препарат анало) гично примеру 2. Активность иммобилизованнойпектиназы по пектину 4670 ед/г,Способ иммобилизации ферментов на носителе,отличающийся тем, что, с целью улучшения свойств препаратов иммобилизованных ферментов, в качестве носителя используют порошок металли- ЗО ческого титана, последовательно обработанный дымящей азотной кислотой и четыреххлористым титаном в присутствии воды. Источники информации, принятые во вниманиеЗ 5 при экспертизе: 1, Наззе 1 Ьегсег Р,Х, ет а., ВВВС, 1974, 57, 1054. Составитель А, БочаровРедактор Т. Загребельная Техред М. Ликович Корректор В. Куприянов Заказ 5572/291 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открьпий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 3и промывают на фильтре 1 н. НИ, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции. Подготовленный к активации порошок металлического титана переносят в круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, капельной воронкой и газоотводной трубкой, добавляют 50 мл дистиллированной воды, охлаждают до 5 - 10 С и к полученной суспензии прикапывают в течение 10 мин 5 мл четыреххлористого титана. Смесь перемешивают. при охлаждении 30 мин, а затем 30 мин при комнатной температуре. Порошок титана отфильтровывают, промывают на стеклянном фильтре дистиллированной водой до нейтральной реакции, высушивают на воздухе и прокаливают при 540 С в течение 3 час. Выход 9 г.П р и м е р 2, Иммобилизация пепсина.К 9 г активированного сорбента приливают 50 мл 2 %.ного раствора пепсина в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,5, смесь взбалтывают на механической качалке в течение 18 час при 4 С. Порошок титана с иммобилизованным ферментом промывают на фильтре от несвязанного фермента 1 М водным раствором МаС до исчезновения светопоглощения при 280 нм в промывных водах и 0,1 М ацетатным буфером рН 4,5) до отсутствия ионов хлора. Активность полученного препарата иммобилизованного пепсина по гемоглобину составляет 1000 ед/г. Активность препарата полностью сохраняется при лиофильном в ысушивании,П р и м е р 3. Иммобилизация протеиназы из Азрегу 11 из огугае, штамм 251.К 1 г активированного сорбента приливают 5 мл 1%-ного раствора протеиназы из Азрегс 1 оз огугае в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,6. Смесь взбалтывают на механической качалке 1 час при 4 С и 10 час при 20 С, Промывают препарат аналоФормула изобретения