Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПА 7 ЕН 1 У Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(31) 53822/72 (оо) Великобритани Государственный комитет Совета й 1 иннстров СССР оо делам изобретений н открытий.932 (088.8) 43) Опубликовано 30.10,77 4 Б) Дата опубликования Бюллет ания 26.12,77(72) Автор изобретения ИностранецАнтони Коуторликобритания ностранная фирмаичам груп Лимитед(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6- АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ кробиоло ф изован. дуюшим Способ закном растворе, бензилпеницил лючается в контактиро при рН в пределах олина или феноксиметилп с водорастворимым котором пеацилазный ани6,0еницил од,0, ина,или его сол рментным омплек сом,ициллнна свя ерм т иесопо.са от2 б н с сахароэо-эпигалогеновым еление ферментного компле нной смеси ультрафильтрацие лимером, и отчодной реакйио Изобретение относится к области мигии и касается получения антибиотиков.Известен способ получения 6. аминопеницилла.новой кислоты путем ферментативного расщепления пенициллина с использованием иммобил Ь його фермента пенициллинамидазы с послевыделением целевого продукта 111.Однако известный способ не обеспечивает высо.кого выхода целевого продукта.Целью изобретения является повышение выхо р да целевого продукта.Эта цель достигается тем, что используют водо- растворимый комплекс фермента с сахарозо-эпигалогеновым сополимером и отделяют ферментный комплекс от реакционной смеси ультрафильтрацией. Водорастворимьтй комплекс содержит фермент-пенициллин деацилаэу, Деацилаэный фермент получают, предпочтительно, иэ бактерий микроор. ганиэмов, таких, например, как штаммы ЕасЬег 1 Ьа со 1, при расщеплении бензилпенициллина, или иэ грибов, или из актиномицетов, при расщеплении феноксиметилпенициллина, рН от 6,0 до 9,0, предпочтительно 7,0 - 8,5, поддерживают добавлением щелочи, например раствора гидроокиси натрия, гид. роокиси аммония или триэтиламина,Для получения водорастворимых ферментных комплексов используют разнообразные водораст. воримые полимерные субстраты, например, полисахариды, такие как декстран, декстрин или целлюлоза, т.е. растворимые в воде и образовывающие водорастворимые комплексы после реакции сочета. ния с деацилаэным энэимом пенициллина.Предпочтительнее использовать модифициро. ванные полисахариды нли алигосахариды, такие как сахароза, декстроза или лактоэа, Наиболее пригодным полимером этого типа является "Фи. колл" - сополимер сахароэы и эпихлоргидрина - с молекулярным весом 400000. Ислользование ука. эанных полимеров гарантирует водорастворимый деапилаэный фермент пенициллина с высокой активностью при получении 6-амннопенишлланово кислоты.Эти ферментные комплексы обладают низкой вязкостью, что позволяет легко выделять их ультрафильтрацией иэ реакционной смеси. 5Водорастворимые комплексы могут быть получены любым из известных методов присоедине.ния ферментов к полимерам, например, присоединением деацилазного фермента к полимеру (сочета.ние с полимером) путем использования таких 10 реагентов, как галогенцианы (бромциан), 8-триаэинов (2 . амин -,4,6 -дихлор. 8 триазин), азидов (2 . окси - 3 . (и . диазофеннл) . пропиловый эфир), органических цианатов (фенилцианат), а икже диорганокарбодиимидов, 15В некоторых случаях ферменты реагируют не.посредственно с полимером, если в нем содержатся после модифицирования некоторые активные группы, такие как ангидридные связи, аминэтильные, оксизтильные или карбоксиметильные заместители, 26Комплексы могут быть получены также связы.ванием фермента с водонерастворнмым полнме.ром, таким как декстран с поперечными связями в молекуле, а затем приданием образующемуся комплексу водорастворимости процессом раэложе ння, например частичным гидролизом нчи взаимодействием декстрана с поперечными связями с де кстраназой.Фермент способен присоединяться к полимеру посредством мостиков, образованных, например, из З 0 диальдегидов, таких как глиоксоль или глицеральдегнд и/или диаминов, таких как 1,6-гексаметилендиамин или этиленднамин, и/или из а-а - аминоали.фатической карбоновой кислоты, такой как ггицин , или 6 аминогексановая кислота.1 35Деацилаэный фермент пенициллина может быть присоединен к полимеру в нпроких пределах соотношений полимер: фермент, например, 0,1 - 100:1, предпочтительным является соотношение полимер:протеин 2;1 - 20:1, 40После получения в.одорастворимый комплекс очищают перед ультрафильтрацией или хромато.графией. Ультрафильтрацнонное оборудование име.ет полупроницаемую оболочку (мембрану) с пределамиисключения", обеспечивающими прохожде ние лишь низкомолекулярных веществ, но пе высокомолекулярных.Предел "исключения" выбирают согласно моле.кулярному весу комплекса таким образом, чтобы гарантировать прохождение 6-аминопенициллано вой кислоты и задержку ферментполимер ного комплекса, который регенерируют для повторного использования.П р и м е р 1. 5 г фиколла молекулярного веса 400000 растворяют в 165 мл воды и доводят рН 55 раствора с помощью 2 н. 1 чаОН до 1 О, Затем к раствору добавляют 400 мг цианогенбромнда, перемешивают магнитной мешалкой, поддерживая температуру 20 С. рН поддерживают 11,0 добавлением 2 н. 1 чаОН. Через 20 мин после добавки цианоген бромида раствор доводят до рН 8,5 с помощью 2 н.НС 1 и смешивают со 170 мл водного растворапенициллиндеацилазы (560 мг протеина), обладающего такой активностью, которая позволяет полу.чать 6,9 ммолей 6-аминопенициллановой кислотына 1 мг протеина в 1 мин при рН 7,8 и 37 С. Раствороперемешивают в течение ночи при 4 С, а затемконцентрируют ультрафильтрацией через мембрануЗмикон ХМ - 300, имеющую номинальный молеку.лярный вес - 300000, Задержанное в ультра.Ьильтрационной ячейке вещество, содержащеефиколл.пенициллиновый деацилазный комплекс,промьвают, уменьшают его объем до 44 мл, ипродукт хранят при 4 С. Задержанное веществообладает вязкостью, сходной с вязкостью нативного фермента,Активность фиколл-пенициллиндеацилаэногокомплекса определяют следующим образом. Фосфатный буфер и бензилпенициллнновый растворстабилизируют при 37 С до рН 7,8 добавкой 0,1 н,МаОН, Для начала реакции добавляют 2 мл знзим.ного раствора. рН реакции поддерживают на уровне 7,8 добавлением 0,1 н, МаОН. Реакция протекает20 мин, и каждую минуту проводят отсчет.Фиколл.пенициллиндеацилазный ферментныйкомплекс удерживает 86,2% активности нативногофермента. Содержание протеина в комплексе устанавливают методом Лаури, Розенбру, Фэрр и Рэндалл. Общий выход сочетания 87,1%,П р и м е р 2. Повторяют опьп по методикепримера 1, но рН, при котором проходит сочетаниедеацилаэы пенициллина и активированного фикол.ла, равно не 8,5, а 10,0. Объем конечного продукта40 мл, Общий выход сопряженного вещества наоснове протеина, задержанного в продукте ультрафильтрацИи, составляет 78,5, ферментная актив.ность 74,8%.П р и и е р 3, Методика аналогична примеру 1,но рН, при котором происходит сочетание междудеацилазой пенициллина и активнрованным фиколлом, равно 6,0, Объем конечного продукта 85 мл,Обиц 4 й выход сопряженного вещества на основепротеина, задержанного в продукте ультрафильтрации, 68%. Фермеитная активность в задержанномпродукте 56,7.%.П р и м е р 4, Методика аналогична примеру 1,но вместо фиколла используют декстран с молеку.лярным весом 250000, Объем конечного продукта44 мл. Раствор декстран-пенициллинового деацилазного комплекса значительно более вяэок, чем удеацилазного комплекса фиколл.пенициллина. Общий выход продукта сочетания на основе удержанного протеина 73,2%. черментная активность, за.держашая в деацилазном комплексе декстранпенициллина, 75,5%,П р и м е р 5. Исследование повторной приме.ннмостн.Раствор деацилаэного комплекса фиколл-пени.циллина, приготовленный по методике примера 1,добавляют к раствору 6,3 г калиевого бензнлпени.35 45 Составитель С. МалютинаТеаред М. Левипкая Корректор Л, Небопа Редактор Н. Хубларова Тираж 677 Подписное Ш 1 ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раугпская наб., д. 4/5Заказ 3815/705 Филиал ППП "Патент",Ужгород, ул. Проектная, 4 циллина в воде и перемешивают при 37 С. Величину рН реакционной смеси поддерживают на уровне 7,8 непрерывным введением 0,1 н. МаОН с использова. нием тритриметра. Реакция завершается через 4 ч, хотя продолжается 6 ч. Выход б-аминопенициллано. вой кислоты 96,2% теоретического. Фермент отде. ляют от реагирующих вешеств небольшого молекулярного веса ультрафнльтрацией через мембрану с молекулярным весом -50000, После промывки фермента в ультрафильтрационной ячейке дистил. лированной водой ферментный полимер снова под. вергают ультрафильтрации до тех пор, пока объем не понижается до 150 мл. Задержанное вещество используют повторно для конверсии дальнейшей загрузки 6,3 г калиевого бензилпенициллииа, который переводят в б-аминопенициллановую кислоту эффективностью 96,5%, Весь цикл повторяют еще три раза, причем выход 6-аминопенициллановой кислоты составляет соответственно 92,0, 96,О и 91,0% от теоретических величин.П р и м е р б, 18,5 мл деацилазного комплекса фиколл.пенициллина, приготовленного по методи. ке примера 1, доводят йо 400 мл дистиллированной водой и перемешивают при 37 С и рН 7,8. Добав. ляют 25 г каш 1 евого бензилпенициллина, и рН под. держнвают постоянным 7,8 непрерывным введе. нием 10 н. МН 4 ОН. Реакцию проводят 4 ч. Фермент отделяют от реагирующих веществ малого молеку. лярного веса диализом против дистиллированной воды, используя диализер из полого волокна с диалиэирующим патроном с молекулярным весом -50000, ферментный раствор концентрируют до -100 мл, Установку диализа промывают аликвот. ными количествами дистиллированной воды 2 я 100 мл, а затем все смешивают с ферментным раствором и хранят нри 4 С между каждым из экспериментов,Семь последовательных экспериментов показа. ли, что эффективность, с которой гидролизуется калиевый бензилпенициллин для образования б.аминопенициллановой кислоты, составляет 93,2%, эффективность регенерации ферментов - 99,6%, из которых 2,5% теряется в пробах, взятых в течение каждого эксперимента, Перед каждым опытом до. бавляют свежий фермент для компенсации любых потерь.П р и м е р 7, Проводят ферментный гидролиз калиевого бензилпенициллина с использованием деацилазного комплекса фиколл-пенициллина пометоду, описанному в примере 6. Реакцию проводят4 ч при рН 7,8 и 37 С. Фермент отделяют от реагирующих веществ небольшого молекулярного веса5 следующим образом. Объем реакционной смесиснижают до -40 мл ультрафильтрацией черезмембрану из полых волокон с молекулярным весом -50000. К концентрату добавляют20 мл дистиллированной воды, и процесс концен 10 трации повторяют. Наливают два аликвотныхобъема жидкости и уменьшают объем до 120 мл вовращающемся испарителе при 35 С. К концентратудобавляют равный объем метилизобутилкетона, исмесь сильно перемешивают в охлажденном метал.о15 лическом сосуде. Когда температура падает до 4 С,медленно добавляют азотную кислоту до рН 4,3. Втечение дальнейших 30 мин продолжают перемеши.ванне. Выпавшую в осадок б.аминопенициллановуюкислоту регенерируют фильтрацией, промывают ме.20 тилизобутилкетоном, водой и ацетоном и высуши.вают в течение ночи при температуре 37 С.П р и м е р 8, Проводят ферментный гидролизкалиевого бензилпенициллина, как описано в примере 6, но при повышенной концентрации калиево.25 го бензилпенициллина (9% вес,/об,), используя 27 гсубстрата в реакционном объеме 300 мл, причемферментная концентрация превышает вдвое ту, ко.торая используется в примере 5. Реакцию проводят4 ч при рН 7,8 и 37 С, Получают б.аминопеницилла30 новую кислоту с выходом 93,2%,Формула изобретения Способ получения б.аминопенициллановойкислоты путем ферментативного расщепления пе.нициллина с использованием иммобилизованного фермента пенициллинамидазы с последующим выделе.нием целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения выхода целевого продукта,используют водорастворимый комплекс ферментас сахарозо. эпигалогеновым сополимером и отделя.ют ферментный комплекс от реакционной смесиультрафильтрацией.Источники информации, принятые во вниманиеурн экспертизе:1. Выложенная заявка Франции У 2019083,кл. С 12 О 13/00, 1970,