Способ определения содержания фосфолипидов в сливочном масле

0 ц 567)33 Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 23.04,75 (21) 2128806/13с присоединением заявки1) М. Кл,- б 01 М 33/04 Гасударственныи камитеСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий риоритет Опубликовано 30,07.77. Бюл ень(088.8) та опубликования описания 08.08.774) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАН фОСФОЛИПИДОВ В СЛИВОЧНОМ МАСЛ Изобретение относится к пищевой промышленности.Известны различные способы определения содержания фосфолипидов в сливочном масле. Наиболее близким к изобретению решением поставленной задачи является широко используемый в настоящее время способ экстракции фосфолипидов из плазмы сливочного масла с последующим хроматографированием экстракта фосфолипидов в тонком слое силикагеля.Известный способ экстракции фосфолипидов заключается в следующем. Сливочное масло (80 в 1 т) расплавляют при температуре 45 С и отделяют плазму центрифугированием. Плазму выдерживают при низких положительных температурах и удаляют застывшие частицы молочного жира. Полученную плазму разбавляют дистиллированной водой, добавляют последовательно ХаС 1, концентрированный раствор аммиака, этиловый спирт, смесь петролейного и диэтилового эфиров, встряхивают и отделяют орга-. ническую фазу, Затем к водной фазе вновь добавляют этиловый спирт, смесь эфиров, встряхивают и отделяют органическую фазу. Объединенные экстракты (органическая фаза) упаривают в вакууме, и полученный концентрат используют для определения фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии.Однако на осуществление такого способатребуются значительные затраты сливочного5 масла, реактивов, труда и времени, при отборе плазмы сливочное масло необходимо выдерживать в течение довольно длительногопромежутка времени при 45"С, что можетпривести к частичному гидролизу и окисле 10 нию фосфолипидов. Известным способом удается извлечь не более 90"/0 фосфолипидов сливочного масла.Целью изобретения является интенсификация процесса, обеспечение полного выделения15 фосфолипидов и исключение изменения фосфолипидов в процессе анализа,Для этого по предлагаемому способу навеску сливочного масла растворяют в хлороформе с получением хлороформного экстракта20 фосфолипидов с молочным жиром и нерастворимого белково-фосфолип идно го остатка,на который воздействуют метиловым спиртомдля получения метанольного раствора фосфолипидов с последующим удалением метанола25 упариванием в вакууме и смешиванием выделенных фосфолипидов с хлороформным экстрактом, полученный объединенный растворнаносят капилляром в одну точку на тонкийслой сорбента и затем хроматографируют в30 системе растворителей, например хлороМасло по известномуспособу по предложенному способу0,1260,006 ф0,1390,0040,1220,0080,139 0,003 0,166 0,018 0,1880,001 0,1850,012 0,189 0,020 16 Сладкосливочиое Крестьянское" ф Среднее значениестандартное отклонение (из пяти опытов), Примечание, Определение фосфолипидов по обоим способам производят после хроматографии экстракта фотодеисиметрическим методом. 50 55 60 Формула изобретения 3форм - метанол - аммиак (25% -ный) в соотношении 14: 6: 1,Пример. К 1 г сливочного масла добавляют 1,3 мл хлороформа, выдерживают в течение 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, осадок на фильтре промывают 0,5 мл хлороформа и затем отдельно 2 мл метилового спирта, после чего осадок (белок) отбрасывают. Спирт удаляют в вакууме при комнатной температуре, и к остатку приливают хлороформный экстракт. Объем смеси доводят до 2 мл хлороформом.Полученный хлороформный раствор фосфолипидов и молочного жира используют для определения содержания фосфолипидов. С этой целью 100 мкл раствора наносят стеклянным капилляром (внутренний диаметр 0,5 мм, длина 40 мм) в одну точку в виде пятна (диаметр не более 12 мм) .на хроматографическую пластину с тонким слоем силикагеля КСК (200 меш),.Цля приготовления хроматографической пластины (12 Х 18 см) тонкий слой из смеси силикагеля (6,0 г), гипса (0,3 г) и воды (15 мл) высушивают на воздухе в течение 24 час, активируют 40 мин при 105 С. При нанесении хлороформного раствора липидов сливочного масла на тонкий слой силикагеля КСК фосфолипиды прочно сорбируются в точИз представленных данных видно, что при определении содержания фосфора известным и предложенным способами большее извлечение фосфолипидов (на,25 - 35%) наблюдается при использовании предложенного способа. Отсюда следует, что при использовании известного способа истинное содержание фосфолипидов удается определить лишь с большой ош и бкой.На чертеже представлены результаты тонкослойной хроматографии на силикагеле КСК фоофолипидов сливочното масла:1 - сладкосливочное масло, фосфолипиды определены известным способом;11 - сладкосливочное масло, фосфолипиды определены предложенным способом;111 - крестьянское сливочное масло, фосфолипиды определены известным способом;1 У - крестьянское сливочное масло, фос 5 10 15 20 25 ке нанесения, в то время как нейтральные липиды (молочный жир) образуют пятно значительно большего диаметра из-за их леткой растворимости в хлороформе. При последующем хроматографировании в системе растворителей нейтральные липиды отделяются от старта и передвигаются с фронтом системы, а фосфолипиды в этой системе образовывают четкие компактные пятна, соответствующие отдельным фракциям фосфолипидов. Хроматографию осуществляют в системе хлороформ - метанол - 25%-ный аммиак (14:6:1 по объему),После хроматографическото разделения пластину проявляют реактивом Васьковского и Костецкого, с которым только фосфолипи.ды дают синие продукты реакции. Проявленные хроматограммы подвергают фотоденситометрированию для определения содержания суммы и отдельных фракций фосфолипидов, Следует отметить, что хроматограммы можно использовать и для определения содержания фосфолипидов другим путем, т, е. экстракцией фосфолипидов из силикагеля с последующим определением липидного фосфора сжиганием,Результаты определения содержания фосфолипидов в сливочном масле по известному и предлагаемому способам приведены в таблице. фолипиды определены предложенным способом;1 - 6 - кефалин, лецитин, сфингомиелин, серинфосфатид, инозитфосфатид, фосфатидные кислоты соответственно.При использовании известного способа выделения фосфолипиды частично разрушаются, поскольку, помимо основных фракций, на хроматотрамме выявляются продукты их частичного разрушения (фосфатидные кислоты). В то же время при использовании предложенного способа продукты изменения фосфолипидов на хроматограмме не обнаруживаются (см. чертеж). Способ определения содержания фосфолипидов в сливочном масле, предусматриваю.. ФСдырт И, ПривалСеменов стави Реда. тор Н корректор Л. Брахнин ларова ед Заказ 34/16Ц 11 ИИП Изд, ЛЪ 607 1 Государственного комит по делам изобретен 113035, Москва, )К, РТпаж 1109ета Совета Министрови и откры иушская наб., д. 4/5 Г 1 од:шсноеР пографпя, пр. Сапунова,щий извлечение фосфолипидов с использованием хлороформа и метиловото спирта и тонкослойную хроматографию выделенных фосфолипидов на силикателе, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения точности анализа, навеску сливочного масла растворяют в хлороформе с получением хлороформного экстракта фосфолипидов с молочным жиром и нерастворимого белковофосфолипидното остатка, на который воздействуют метиловым спиртом для получения метанольного раствора фосфолипидов с последующим удалением метанола упариванием в вакууме и смешиванием выделенных фосфолипидов с хлороформным экстрактом, а полученный объединенный раствор наносят капилляром в одну точку на тонкий слой сорбента и затем роматографируют в системе растворителей, например хлороформ - метанол - ам миак 25%-ный в соотношении 14: 6: 1. о о . ае -