Способ получения кормовой добавки для сельскохозяйственных животных

111 Бта 3897 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(31)Опубликовано Государственный комите Совета Министров СССРпо делам изобретений.06.77. Бюллетень24 крыт Дата опублико ния описавя 19,09.7 2) Авторы изобретсиия Иностранцы Кеиворти и Филип(Великобритания) Иностранная фирма Юнилевер Н. Ф,(Нидерланды)еимо р 1) Заявител 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЪХ ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к области получениякормовых добавок для сельскохозяйственных животных, преимущественно для телят, на основе продуцентов микроорганизмов.Известны способы получения кормовых добавок путем выращивания микроорганизмов, например, бактерий, продуцирующих молочную кислоту.Однако получаемые таким способом добавки не оказывают какого-либо профилактического действия на организм животного, так как бактерии, используемыс для их приготовления, не являются патогенными.Наиболее близок к изобретению способ получсния кормовой добави на Основе выращивания патогенного микроорганизма.Недостаток такого способа состоит в том,что получаемый продукт ис содержит в достаточном количестве эидотокспнов, которые наиболее важны для создания высокого иммунологичсского эффекта.Телята, особенно первые дни жизни, склонны к расстройствам желудочно-кишечного тракта, преимущественно к сальмонеллезу и расстройству, вызываемому патогенными бактериями Еэс 11 епс 111 а со 11. Наиболее часто это происходит при транспортировках, изменениях рациона и т. и. Целью изобретения является повышение сопротивляемости организма телят к желудочно-кишечным заболеваниям.Для этого по предлагаемому способу куль 5 тивируют микроорганизмы Ядшопе 1 а диЫ 1 пи/или башопеа 1 ур 111 п 1 цг 1 п 1 п, и/или Евс 1 тспС 111 а со серотипов 08 и/или 09, и,или 015,и/или 078, и/или 0114, и/или 0137, и/или 0139,затем бактерии отделяют от культуры, суспсн 10 дируют, и полученну 1 О суспензию подвергаюттермообработке для выделения эндотокс 11 нов,при этом термообработку ведут ири температуре 68 в 1 С в течение 30 - 60 м 1 ш, и дляболсс эффективного выделения энцооксинов15 суспензию после тсрмообработки обрдбдгыва 1 от этанолом или трипсином,Технология способа состсн 1 т в следующем.Получение и выделение эндотоксинов. Зидотоксины получают из штаммов Ядп 1 опс,д и20 семи ссротипов Е. со методом, которьш согласуется с методом Вестф;1;1 я, Л 10 дс рпцз иБистера.Высушенную ири замораживашш культурумикроорганизмов восстанавливают в иептоно 25 вой воде и выдерживают 6 ч в термостате пр:37 С. После выращивания культуру провсряют на чистоту на пластинке агар-дгдрд с промытой овечьей кровью, а затем использчот5 10 15 20 5 30 35 40 45 50 55 60 65 для инокулирования твердых косых питательных сред (питательный агар, оксоид) в колбах Ру. Культуру выращивают при 37"С в течение ночи, и бактерии собирают в стерильную дистиллированную воду. Полученную бактериальную суспензию переносят асептически в 30-миллиметровые универсальные склянки и центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин, Жид. кость удаляют, остаточные гранулы бактерий повторно суспендируют в 4 мл стерильной дистиллированной воды, а затем высушивают вымораживанием.Для выделения эндотоксинов 0,5 г высушенного замораживанием материала суспендируют в 5 мл 0,15 М ЯаС и растворяют в 10 мл 90 О/,-ного водного фенола. Смесь нагревают 30 мин при 68"С, непрерывно перемешивая, после чего ее центрифугируют при 4000 об/мин для уплотнения остатков клеток. Водную фазу удаляют, охлаждают до 4"С и медленно добавляют к ней 10 объемов охлажденного льдом этанола. Образующийся осадок вновь растворяют в воде, и из раствора добавлением двух объемов этанола осаждают нуклеиновые кислоты, которые удаляют. Из остаточного раствора осаждают эндотоксины, вводя 8 об ьемов этанола. Их отделяют центрифугированием, промывают охлажденным на льду этанолом и повторно растворяют в 0,15 М КаС. Получают раствор эндотоксинов - реагент1.Получение иммунной сыворотки, Для получения специфической гипериммунной сыворотки используют промытые инактивированные нагреванием (100 С, 2,5 ч) организм Е. со и Ьатопеа. Из них на основе раствора 0,1 М ХаС готовят суспензию, содержащую 3 Х Х 10 организмов на 1 мл, которую вводят внутривенно новозеланским белым кроликам. Иммунизацию начинают с дозы 0,1 мл и каждый четвертый день дозу удваивают. Через 10 дней по завершении программы иммунизации у кроликов берут кровь, центрифугируют ее и собирают верхний слой - гипериммунную сыворотку (реагент2). Для определения активности антител (антиэндотоксинов) в иммунной сыворотке 5 О/о-ную суспензию промытых клеток эритроцитов овцы сенсибилизируют одинаковым объемом раствора эндотоксинов (реагент1) при 37 С в течение 30 мин. Сенсибилизированные клетки разделяют центрифугированием, отмывают от избытка эндотоксинов и повторно суспендируют в 0,15 М КаС для получения 2,5/О-ной суспензии из эндотоксина и сенсибилизированных эритроцитов овцы (реагент3). Иммунную сыворотку разбавляют последовательно 0,15 М раствором КаС и получают растворы равного объема (1 объем) с концентрацией антител 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 1/(5 Х Х 2" ). Затем к каждому из этих растворов добавляют 1/5 объема реагента3. Гемагглютинация происходит в более крепких растворах иммунных сывороток, а не в более слабых, и за конец титрования (при 4 С) принимается раствор, в котором гемагглютинация происходит сразу. В типичном процессе это может быть двенадцатый раствор реагента2, т. е. раствор с концентрацией антител (5 Х 2") и с титром 5 Х 2"=10240.Прп измерении концентрации эндотоксинов испытуемый раствор (У) последовательно разбавляют 0,15 М раствором ХаС и получают растворы равного объема (3 объема) с концентрацией эндотоксинов 1/3, 1/6, 1/12, 1/24 и т.д.К каждому из этих растворов добавляют 1 объем реагента2 с титром 20 и через несколько минут 1 объем реагента3 и получают новые растворы с конечными концентрациями эндотоксинов 1/5, 1/10, 1/20, 1/(5 Х Х 2" - ). В типичном процессе гемагглютинация заканчивается сразу в шестом растворе с концентрацией эндотоксинов 1/(5 Х 2") и титром 5 Х 2=160, что эквивалентно 160 единицам эндотоксина на 1 мл,Для получения сырого эндотоксинного материала бактерии основного штамма микроба высевают штрихом на промытые пластинки агара и крови (для Езс 1 егсЫа со 1) или на пластинки питательного агара (для Ьа 1 гпопе 1 а) и выдерживают 24 ч в термостате при 37 С, Затем пластинки проверяют на чистоту штаммов.Колонии бактерий переносят с пластинок в 50 мл оксоидного питательного бульона2 (каталогСМ 67) и выдерживают 24 ч в термостате со встряхиванием при 37 С. Полученной культурой инокулируют 15 л питательного оксоидного бульона2, который нагревают, перемешивая, при 37 С в течение 24 ч. Каждая полученная таким образом окончательная культура содержит 10 - 10" жизнеспособных бактерий на 1 мл.Пробы культур Е. со 1, пропариваемые 2 ч при 125 С, дают титр 2560, что соответствует 2 560 единицам эндотоксина на 1 мл пропаренной культуры. Пробы культур Ьагпопе 1 а дцЬ- и и Затопеа 1 уршпцгцш, обработанные аналогично, дают титр 1280 каждая. Каждую из девяти культур (семь Е. со 1 и по одной на каждый из серотипов 5 агпопе 1 а) центрифугируют для разделения бактерий, которые затем повторно суспендируют в части отделившейся жидкости с целью получения суспензии с концентрацией в 30 раз превышающей концентрацию культуры до центрифугирования, Каждую суспензию отдельно пропаривают 2 ч в автоклаве (125 С) для умерщвления бактерий, а затем все девять смешивают.Получение корма для телят. Смешанные пропаренные суспензии (1 вес. ч.) перемешивают с порошком сыворотки молока и вводят в стандартный заменитель молока следующего состава, вес, о/О:Составитель Е. АрскаяРедактор Н. Хубларова Тсхред Л, Гладкова Корректор Л. Котова Заказ 1657/5 Изд. М 595 Тираж 585 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Я(-35, Раушская паб., д. 4,5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 Порошок простокваши сдобавкой жиров 77,0Порошок сывороткимолока 17,1ГлОкоза 5,0 Осажденный мсл 0,3 Дикальцийфосфат 0,4 Следь минералов и витамины в носителе 0,2Получают продукт с концентрацией эндотоксинов каждого серотипа Е. со 11 100 ед./кг корма и каждого серотипа с 5 атпопе 11 а 50 ед./кг корма. Формула изобретения1. Способ получения кормовой добавки для сельскохозяйственных животных, преимущественно для телят, включаюций культивированне патогенных микроорганизмов, о тл и ч аю:цийся тем, что, с целью повышения сопргивлясмости тслчт и желудочно-кишсчным заболеваниям,льтивируОт ми 5 ероорганиз 5 ы Ьа 1 птопс 11 а апз 11 п и/или Яап 1 опс 1 а 1 ур 1 пп- ппп и/или Евспсгс 11 а со 1 серотипов 08 и/или 09, и/или 0,15, и/или 078, и/или 0114, и/или 0137, и/или 0139, затем бактерии отделяют от культуры, суспендируют, и полученную сус пензию подвергают тсрмооораооткс для выделс и 5 эндотоксп и Ов.2. Способ по п. 1, отл ич а ющий ся тем,что термообработку ведут при температуре 68 - 125 С в течение 30 - 60 мин.15 3. Способ по п, 1, отличающийся тем,что, с целью более эффективного выделения эндотоксинов, суспснзию после тсрмоооработкп обрабатывают этаиолом или трипсином.