Способ получения -дигидрокси -3-4-фенилаланина

о п Г%"й"и е ИЗОБРЕТЕН ИЯ пц 452 О 3 Союз Советских Социалистических Республик(ЗЗ) ФранцияОпубликовано 30.11.74. Б,оллетень М Государстваииый коми Совета Мииистров ССС ло делам изобретеиий 3) УДК 663.18(088.8) крытии та опубликования описания 30.09.75(Франция) Рен 71) Заявитель Иностранная фирма Рон-Пуленк С. А,(Франция)" др Однако т выхода 1.-д С целью предложен фенилалани продуцента Ысцз АТСС Клетки э искривленн На питател образует о цвета ИЬг61) Зависимый от патента Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения 1.-дигидрокси,4-фенилаланина путем микробиологического преобразования тирозина.Известен способ получения 1.-дигидрокси,4-фенилаланина, состоящий в культивирозании продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода и источник азота, в присутствии тирозина с последующим выделением 1.-дигидрокси,4-фенилаланина, Прп этом в качестве продуцента используют различные микроорганизмы, в частности М 1 сгозр 1 га 1 угоз 1 паЫса, И 1 ос 1 ас 11 цт с 1 е 1 щцез сепз акой способ дает низкий процентигидрокси,4-фенилаланина.устранения указанного недостаткаспособ получения 1.-дигидрокси,4 на, согласно которому в качествеиспользуют штамм ИЬг 1 о угоз 1 па 19378.того штамма имеют удлиненную иую форму, соединены в цепочки,ьной среде с агар-агаром штаммбильную рыхлую культуру белогоо 1 угоз 1 па 11 сцз АТСС 19378, Разжижает желатин, не гидролизует агаразует пигмент на питательной средеНа питательной среде с агаром и тштамм образует черный пигмент, сод р 1.-дигидрокси,4-фенилаланин.Процесс получения 1.-дигидрокси,4-фенилаланпна проводят в две фазы при различном значении рН, На первой фазе выращивают указанный продуцент при рН 6,0 - 7,8, на вто рой - преобразовывают тирозин в 1.-дигидрокси,4-фенилаланин при рН 4,0 - 7,0, При этом тирознн вводят в виде щелочного и кислотного растворов.На фазе преобразования тирозина добавля ют глюкозу, 1.-аскорбиновую кислоту, антиокпсляющпй агент и соли меди.Предложенный способ осуществляют следу 1 ощи м обр азом,На первой фазе культивируют штамм %Ьг 1 о 20 1 угоыпа 11 сцз АТСС 19378 на питательной среде при рН 6,0 - 7,8 (предпочтительно между 6,5 и 7,5) преимущественно при 25 - 26 С.Выращивание культуры проводят при перемешпваппи и аэрации.25 Питательная среда содержит источник углерода, источник азота и минеральные элементы.5 1 О 15 В качестве источников углерода используют глюкозу, мальтозу, декстрипы, крахмал, глицерин, мелассу и лругие вещества.Взамен гидроуглеродистых соединений могут быть применены животные и растительные жиры и масла, такие как свиное сало или соевое масло.Источниками азота могут быть минеральные или органические соли аммония, мочевпна и некоторые аминокислоты.Они могут быть внесены и в виде казсина, лактобумина, клейковины, соевой, арахпсовой и рыбной муки, мясных экстрактов и дрожжей.В качестве добавляемых в питательную среду минеральных элементов могут быть использованы щелочные и щелочноземельныс фосфаты или карбонаты кальция и магния.Во второй фазе в питательную среду добавляют 1.-тирозин в колич:стге, преимущественно от 3 до 10 г/ч Гг" в юс" ччечпочтп"сльно после роста продуцспта г течение 16 - 24 час, используя одновременно щелочной раствор тирозина и его раствор в солпой кислоте.После внесенпяелочного и кислотного растворов тирозкна культуру выдерживают в течение одного-двух дней в тех ке условиях,В начале фазы преобразования тирозина в культуру может быть дополнительно введена глюкоза и добавка для контроля рН культуры,Преобразование ти,;озина можно осуществлять в присутствии аскорбиновой кислоты, которую добавляют (в один или несколько приемов в количестве 1 - 5 г/л) в период фазы роста продуцепта либо после внесения в питательную среду 1.-тирознна.После завершепия фазы преобразования тирозина приступают к выделению 1.-днгидрокси,4-фенилалапина, Для этого сусло после окисления до рН 2 подвергают фильтрации или центрифугированию. В этом случае 1.-дигидрокси,4-фепил алании мояет последовательно удерживаться на катионообменной смоле типа сульфидной и на глиноземе в присутствии этилендиаминотетрауксусной кислоты и метабисульфита натрия.1.-дигидрокси - 3,4 - фенил алании, задорканный на глиноземе, элюируется раствором щавелевой кислоты и, после ее удаления, очищается путем перекристаллизации,П р и м е р 1, Готовят питательную среду следующего состава (г):Дрожжевой экстракт 40 Пептон 80 Мясной экстракт 80 Моногидратная глюкоза 160 Хлорид натрия 80 Вода 17 (л).Путем внесения в среду 22 см едкого натра (10 н) устанавливают рН 7,5.Приготовленную среду стерилизуют при 122 С в течение 40 мин,Охлажденную среду при рН 6,95 засевают 200 см культуры %Ьг 1 о 1 угоз 1 па 11 спз АТСС 19378 в колбе Эрленмейера, Культура разви 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 вается при 26 С в течение 16 час при перемешивании и аэрации стерильным воздухом.Затем рН культуры доводят до 5,3 путем внесения стерильного раствора соляной кислоты 2,4 н, После этого в среду добавляют 64 г тирозина в виде двух растворов одинакового объема - первый с 20% в соляной кислоте (2,4 н.) и второй с 20% в едком натре (2,4 н.).Кроме того, в питательную среду добавляют 350 см раствора, содеркащего 160 г моногидратной глюкозы, и выдерживают культуру в течение 27 час, поддеркивая рН 5,3.В конечном объеме, составляющем 14 тигрованных литров, содержится 3,0 г/л 1.-дигидрокси,4-фенилаланина. П р и мер 2, Часть (1,8 л) преобразованной культуры, описанной в примере 1 и содержащей 5,4 г 1. - дигидрокси - 3,4 - фенилаланина, окисляют 50 см соляной кислоты 12 н. при рН 2 и центрифугируют. Собранную жидкость пропускают на столбик смолы Ровех 50%-х в виде кислоты (смола на основе полистиренсульфокислоты с 2 %,дивннилбензола).1.-дигидрокси,4-фенилаланин элюируется 2 и. соляной кислотой. Злюат (5,2 л), содержащий небольшое количество непреобразованного тирозина, очищают, устанавливая его рН 4,0 за счет введения 800 см едкого натра (с 1 1,33), 250 г глинозема, 5 г метабисульфита натрия и 5 г этилендиаминотетрауксусной кислоты в виде двусодистой соли. Смесь перемешивают, доводят рН до 8,6 путем внесения 200 см концентрированной соды и выдерживают в течение 15 мин.Глинозем отделяют путем фильтрации и несколько раз промывают тремя литрами дистиллированной воды, Фильтрат и промывная жидкость, содеркашне в ссбе тирозин, удаляются, а 1.-дигидрокси,4-фенилаланин отделяется при обработке глинозема 2,2 л щавелевой кислоты 2 и. Щавелевый раствор концентрируют в 0,7 л при пониженном до 30 мм рт. ст. давлении путем нагревания в водяной бане. Цавелевую кислоту удаляют фильтрацией. Затем фильтрат обрабатывают 3,7 л этилового спирта, доводят его рН до 5,5 и добавляют 150 см едкого патра (й 1,33) и 3,7 л ацетона для выпадения минеральных солей. Полученный осадок фильтруют, а фильтрат концентрируют под давлением 30 мм рт, ст. путем нагревания в водяной бане до 0,8 л. Концентрацию фильтрата заканчивают при нормальном давлении в атмосфере азота и нагревании с помощью,парафиновой бани до получения 70 см раствора, Полученный раствор выдерживают в течение 10 час при 40 С, после чего из него выделяют 2,54 г неочищенного 1.-дигидрокси,4-фенилаланина,Очистку этого продукта проводят путем перокристаллпзации воды после осветления вод ного раствора с помощью активного углерода. Таким образом получают кристаллизованное вещество 1.-дигидрокси,4-фенилаланин с выходом 49%,5 10 15 20 25 30 35 40 50 55 60 П р и м е р 3. Готовят питательную средуследующего состава (г):Дрожжевой экстракт 100Пептон 200Мясной экстракт 200Хлорид натрия 200Вода 33 (л).РН среды устанавливают равным 7 путемдобавления 40 см соды 10 н. Среду стерилизуют, барботируя ее паром при 122 С в течение 40 мин. Охлажденная среда имеет объем38,5; его доводят до 40 л за счет добавления1,5 л стерильного водного раствора, содержащего 600 г моногидратной глюкозы.Среду с рН 6,9 засевают 200 см культурыЪ 1 Ьпо 1 угоз 1 па 11 сиз АТСС 19378 в колбеЭрленмейера.Культуру гыращивают при 30 С в течение10 час при перемешивании и аэрации стерильным воздухом. Производственную культуру готовят в бродильном чане емкостью 800 л с2,2 кг согп Меер (50/о сухого экстракта),0,220 кг сульфата марганца и 390 л воды,После установления рН 6,6 с помощью120 см 10 и. едкого натра в чан добавляют1,1 кг карбоцата кальция, Полученную средустерилизуют путем ее парового барботпрования при 122 в течение 40 мин.Охлажденная питательная среда имеетобъем 425 л, его доводят до 440 л за счет внесения в среду 10 л стерильного водного раствора, содержащего 4,4 кг моногидратной глюкозы, и 5 л стерильного водного раствора, содержащего 0,880 кг сульфата аммония.Полученную питательную среду с рН 7 засевают 6 л культуры ИЬг 1 о 1 угоз 1 па 11 сцз вбродильном чане емкостью 75 л. Культураразвивается при 30 С в течение 20 час приинтенсивном перемешивании с помощью центрифуги, вращающейся со скоростью180 об/миц, ц аэрации стерильным воздухом,иопользуемым в количестве 20 м/час.РН среды поддерживают 6,6+-0,05 путемдобавления 6 н. аммиака цли 4 и. соляной кислоты,Через 20 час роста продуцента объем суслаустанавливают равным 400 л, а рН доводятдо 5,5 с помощью 6 н. соляной кислоты.Затем в питательную среду вводят 1,1 лводного раствора (рН 5,5), содержащего 215 г1.-аскорбиновой кислоты, и выдерживают в течение 2 час при 30 С и интенсивном перемешивании.В выдержанное сусло вводят 1,1 л водногораствора (рН 5,5), содержащего 215 г 1.-аскорбиновой кислоты, и 1,720 кг 1.-тирозина в видедвух растворов концентрации 6,15 О/о - в 1 н.едоком натре и в 1 н. соляной кислоте. Затемв сусло последовательно с интервалом в 1 часвводят 1,1 л водного раствора 1 -аскорбиновойкислоты при рН 5,5.После введения указанных добавок культуру выдерживают в течение 7 час при рН 5,5. Окончательный объем сусла составляет 430 л. Количество 1. - дигидрокси - 3,4- фенилаланцна, присутствующего в нем, составляет 3,55 г/л.П р и м е р 4. Культуру ИЬпо 1 угоз 1 паИсцз АТСС 19378 готовят в соответствии с примером 3. После выдерживания в течение 20 час объем сусла равен 400 л, рН 6,6.Затем в сусло вводят 2,2 л водного раствора, содержащего 400 г 1.-аскорбиновой кислоты, при рН 6,5 и, интенсивно перемешивая, в течение 2 час при 30 С аэрируют стерильным воздухом в количестве 20 мз/час, Затем вновь вводят 2,2 л водного раствора (при рН 6,5), содержащего 400 г 1.-аскорбиновой кислоты,Кроме того, в питательную среду добавляют 1,720 кг .-тирозина в виде двух водных растворов концентрации 6,15 О/, - в 1 н. едком цатре и в 1 н. соляной кислоте.Затем в питательную среду последовательно с интервалом в 1 час вводят две добавки водного раствора по 1,1 л при рН 6,5, содержащие каждая по 200 г .-аскорбиновой кислоты, и добавку 2,2 л водного раствора, содержащего 400 г 1.-аскорбиновой кислоты, Культуру выдерживают 7 час, поддерживая рН сусла 6,6.Окончательный объем сусла составляет 430 л, количество .-дигцдроксц,4-фенцлаланина - 2,79 г/л.Предмет изобретения1. Способ получения 1.-дигидроксц,4-фенцлалаццпа путем культивирования продуцента на питательной срее, содержащей источник углерода ц источник азота, в присутствии тцрозина с последующим выделением 1.-дцгидрокси,4-фенцлаланцца, отл цч а ю щи йся тем, что, с целью повышения выхода 1.-дцгцдрокси,4-фенилаланпна, в качестве продуцецта используют штамм 11 Ьпо 1 угоз 1 па 11 сцз АТСС 19378.2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс ведут в две фазы, на первой цз которых осуществляют рост продуцента прц рН 6,0 - 7,8, а ца второй - преобразование тирозина в 1.-дигидроксц,4-фенцлалапцц прц рН 4,0 - 7,0,3. Способ по пп. 1 и 2, отл ц ч а ющц йс я тем, что тирозин в питательную среду вводят в виде двух растворов - щелочного и кислотного.4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем, что на фазе преобразования добавляют глюкозу. 5. Способ по пп. 1 - 4, отл и ч а ю щ и й с я тем, что на фазе преобразования тирозцца в 1. - дигидрокси - 3,4 - фенилаланцн добавляют 1.-аскорбиновую кислоту и антпокцсляющцй агент,6. Способ по пп. 1 - 5, отличающийся тем, что на фазе преобразования тпрозцна в 1.-дигидроксц,4-фенцлалашш добавляют соли меди.