Способ получения l-лизина

О П ИСА НИ Е ИЗОБРЕТЕНИЯ 0 ц 440848 Союз Советских Социалистических Республик(33) ЯпонияОпубликовано 7.02.69 (31) 14776/6908.74. Бюллетень31 Гобударствеинык комите Совета Министров ССС 53) УДК 663.14(088 по делам изобретений и открытий та опубликования описания 29.04,7 72) Авторы зобретения ностранцыЯпония) ндзи мура, фумихиро Иосинага, Ясухико кира Камимура и Тадауки Кадзив Иосихара,а аявитель Иностранная Аджиномото(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН ЛИЗИНА Изобретение относится к микробиологической промышленности.Известен способ получения Л-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов Вгеч 1 Ьас 1 ег 1 цгп на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и азота ацетатные ионы и необходимыс для синтеза питательные соли с последующим выделением /-лизина.Предлагаемый способ увеличивает выход аминокислоты.Достигается это тем, что из рода Вгеч 1 Ьас 1 ег 1 цгп используют штамм Пачцтп АТСС 21129,При этом концентрацию ионов ацетата в среде поддерживают равной 1,5 вес. %, а рН среды 7,0 - 8,5.Для получения Е,-лизина из культуральной среды по предлагаемому способу в качестве источника углерода используют соли уксусной кислоты, такие как ацетат калия, ацетат натрия, ацетат аммония и ацетат кальция, или уксусную кислоту, а в качестве источника азота - мочевину, аммиак или соли аммиака, такие как хлористый аммоний, сульфат аммония и карбонат аммония.Ацетат аммония применяют в качестве вещества, которое одновременно служит источником углерода и азота. Кроме источников углерода и азота добавляют сооответствующее количество минеральных составляющих, витаминов или витаминосодержащих веществ для окончательного5 формирования среды. В качестве таких веществ используют витамины Вь биотин, дрожжевые экстракты, жидкость после вымачивания зерна, белковый гидролизат из соевых бобов, рыбную муку, вываренную рыбную муку,10 гидролизат казеина.Микроорганизмы, которые способны к выделению /.-лизина в среде, содержащей ацетатные ионы в качестве источника углерода, широко распространены. Такие микроорганизмы15 получают в виде мутантов, имеющих определенные биохимические характерные особенности, которые известны в процессах ферментативного получения 1,-лизина, использующегокарбогидраты в качестве основного источника20 углерода.Микроорганизмами, которые могут продуцировать /.-лизин, используя ацетатные ионыв качестве основного источника углерода, является например: Вгеч 1 Ьасег 1 цгп 11 ачцп 1,25 ВгечЬасег 1 цтп 1 ас 1 о 1 еггпепцп 1, Вгеч 1 Ьас 1 сг 1 п 1 па 1 птпоп 1 адепез, СогупеЬас 1 ег 1 цгп асе 1 оас 1 с 1 орЬ 11 цтп, Мтсгососсцз дц 1 аписцз ц АгйгоЬасЬгега 1 гецз,Гидр олизат крахмала (рассчитанный по глюкозе) Ацетат аммонияКН,Р 04Мд 804 7 Н 20РеМпБелковый гидролизат из соевых бобов 1,5 о/о9,3 о/ 0,1 о/о 0 04 о/о 2 ррт 2 ррт 3 ррт Способ заключается в следующем,На первой стадии микроорганизмы высевают на исходную среду, содержащую вместе сацетатными ионами в количестве меньше 4 о/о(предпочтительно менее 2 о/о) и проводятаэробное выращивание микробов при перемешивании,Так как прибавленные в начале ацетатныеионы в исходной среде ассимилируются,по мере инкубации, в среду во время выращивания бактерий непрерывно или периодическивводят ацетатные ионы вместе с источникомазота. Введение ацетатных ионов во времякультивации ведут так, чтобы концентрацияацетатных ионов в среде не превышала 1,5 о/о,и чтобы значение рН культивируемой средыбыло от 7 - 8,5.Для установления концентрации ацетатныхионов и рН в среде используют раствор изсмеси уксусной кислоты и ацетата аммониясоответственно 1: 0,5 - 0,75, предпочтительно1: 0,1 - 0,5,Когда раствор из смеси с указанным молярным соотношением подают в среду, поддерживая в ней значение рН между 7,0 - 8,5,концентрация ацетатных ионов в среде непревышает 1,5 вес. о/о. Если содержание ацетата аммония в растворе смеси больше этихзначений, концентрация остаточной уксуснойкислоты в культуральной среде увеличивается и соответственно продуцирование Ь-лизиназамедляется. И наоборот, когда это содержание меньше, соотношение между углеродом иазотом в среде становится неподходящим дляпродуцирования Е-лизина.В тех случаях, когда источник азота, такойкак газообразный аммиак, водный раствор имочевину подают отдельно, проверяют рН среды для того, чтобы оно имело значение между 7 и 8,5 и концентрацию ацетатных ионовдля получения хорошего выхода 1-лизина.Для увеличения выхода 1.-лизина в культуральную среду вводят карбогидраты вместес ацетатными ионами в виде их смеси. Общееколичество добавляемых в среду карбогидратов во время ферментации находится в пределах 20/о (предпочтительно 5 в 15/о), исходя из расчета общего количества ацетатныхионов, добавляемых в среду.Извлечение Е-лизина из питательной средыведут известными способами, например припомощи ионообменных смол.П р и м ер 1. ВгечЬас 1 ег 1 цп Пачцш АТСС21129 высевают на культуру (рН 8) следующего состава:15 0,7 о/о0,2 о/,0 04 о/о Р 1.-метионин 10 мг/дл Биотин 50 у/л Витамин В НС 1 200 у/л,Инкубацию ведут в течение 11 час при31,5 С в аэробных условиях.Основную культуральную среду вводят встеклянные ферменторы-качалки небольшого размера порциями по 300 мл. Все порции стерилизуют при 110 С в течение 10 мин, щ Основная культуральная среда (рН 6,5)имеет следующий состав:Ацетат аммония 1 2 о/о КНР 04 0 2 о/о Мд 504 7 НО 0 04 о/о Ее 2 ррт Мп 2 ррт Белковый гидролизат из сое мл/длвых бобов1,-треонин 15 мг/дл 0/,-метионин 30 мг/дл Биотин 50 у/л Витамин В НС 1 40 у/л Мочевина 0,2 о/о,15 мл обсемененного,питательного бульонадобавляют к основной культуральной среде в ферменторе и ведут инкубацию при 31,5 С, перемешивая среду со скоростью 1350 об/мин при аэрации в том же объеме в 1 мин, что и для бульона. После 5 час,культивирования значение рН культуральной среды становится равным приблизительно 8,2. Автоматически подают водный раствор, содержащий уксусную кислоту в количестве 40/о и газообразный аммиак, сохраняя концентрацию уксусной 35 кислоты в среде ниже 1 5 вес. /о и значениерН между 7,5 и 8. Таким образом, в 48 час культуре накапливается 4,34 г/дл Ь-лизина (эквивалентно 25,2 вес. о/о относительно всего количества используемой уксусной кисло 4 о ты), Количество уксусной, кислоты, введенноев среду, составляет 17/о по весу от количества исходной среды.Из 390 мл питательного бульона получают13,7 г неочищенного кристаллического -ли зина.П р и м е р 2. Основную культуральную среду вводят в пять стеклянных ферменторовкачалок небольшого размера, порциями по 300 мл соответственно.50 Все порции стерилизуют при 110 Св течение10 мин. Обсемененный культуральный бульон в количестве 15 мл, приготовленный тем же способом, что и в примере 1, добавляют в основную культуральную среду в каждом стек лянном ферменторе, Инкубацию ведут при перемешивании (1350 об/мин),в условиях аэрации в том же объеме, что и для бульона.Основная культуральная среда (рН б,5)имеет следующий состав:60 Ацетат аммония 12 о/оГидролизат крахмала (рас о/осчитанный по глюкозе)Сульфат аммонияКНР 04б 5 Мд 50 7 НрО2 ррт2 ррт4 мл/дл РеМпБелковый гидролизат из соевых бобовЕ-треонин 15 мг/дл 0/.-метионин 30 мг/дл Биотин 50 у/л Витамин В 1 НС 1 40 у/л Мочевина 0,2%.Когда значение рН среды становится равным приблизительно 8,2 после 5 час культивации, растворы смесей из уксусной кислоты и ацетат аммония (концентрация уксусной кислоты в растворе 60%), имеющие молярные соотношения, приведенные в табл. 1, вводят в каждый фермептор до тех пор, пока значение рН среды не становится равным приблизительно 7,5. Раствор добавляют автоматически, когда значение рН среды возрастает до 7,7.Добавление смешанного раствора прекращают для 46 час,культуры, и далее ведут дополнительную инкубацию в течение 2 час (48 час в общем).Выход Е-лизина в каждом ферментируемом бульоне приведен в табл. 1. Таблица 1 Образовавшийся Л-лизии в виде гидро- хлорида Моляриое отношение уксусной кислоты к ацетату аммо ния1,03 1,25 1,15 1,08 0,98 1:0,051;0,251:0,501:0,751:1 22,8 28,9 24,8 19,7 13,2 3,79 6,05 4,243,51 2,43 П р и м е р 3. Основную культуральную среду подают порциями в 300 мл в ферменторы-качалки небольшого размера и стерилизуют,при 110 С в течение 10 мин.Основная культуральная среда (рН 6,5) имеет следующий состав:Ацетат аммония 12% Гидролизат крахмала (рас О/осчитанный по глюкозе)Сульфат аммонияКНРО 4Мд 504 7 Н 20РеМпБелковый гидролизат из соевых бобов1,-треонин 15 мл/дл 0,7% 0,2% 0 04 о/о 2 ррт 2 ррт 4 мл/дл О. П. - бактериальиый рост измеряли, используя электрофотокалориметр Н 1 тата модель 11 В по оптической плотности (ор Т величины) при 562 т (О, П,) бульона, разбавленного в 26 раз, Субстрат в уксусн кислота и глюкоза (для табл. 1 и 2), Ж-метионин 30 мг/дл Биотин 50 у/л Витамин В 1 НС 1 40 у/л Мочевина 0,2%Обсемененный культуральный бульон Вгеч 1 Ьас 1 ег 1 цш Пачцгп АТСС 21129 в количестве 15 мл, который готовят так же, как в примере 1, добавляют к основной культуральной среде в ферменторе-качалке. Инкубацию ведут при 31,5 С при скорости перемешивания 1400 об/мин с постоянной степенью аэрации.После 5 час культивирования рН культу- ральной среды становится равным приблизительно 8,2. Поэтому в каждой ферментер начинают подачу раствора (концентрация уксусной кислоты в растворе 60%), состоящего из смеси растворов уксусной кислоты и ацетата аммония с молярным соотношением 1: 0,25 и гидролизата крахмала (рассчитанного по глюкозе) возрастающей концентрации (см. табл. 2),Раствор подают в каждый ферментор - качалку до рН 7,5. Подачу раствора повторяют автоматически, если рН среды увеличивается приблизительно до 7,7,Добавление этого раствора прекращают для 58 час культуры и затем ведут дополнительную инкубацию в течение 2 час (в сумме 60 час). Выход Ь-лизина в каждом ферментируемом бульоне приведен в табл. 2. Таблица 2 Образовавшийся Е-лизии (в видегидрохлорида) Коицеитрация уксусной кислоты,выход по субстрату о40 25,0 30,0 32,5 33,8 31,3 29,0 7,14 8,26 8,87 9,25 8,40 7,83 1,13 1,16 1,22 1,27 1,31 1,36 01,5345912 2,55101520 50 Предмет изобретения 1, Способ получения Ь-лизина путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов ВгечЬас 1 ег 1 цш на питательной среде, 55 содержащей в качестве источника углерода иазота ацетатные ионы и необходимые для синтеза питательные соли с последующим выделением Е-лизина, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода аминокисло ты, из рода ВгелЬас 1 ег 1 цгп используют штамм11 ачцгп АТСС 21129.2. способ по п. отличающийся тем, чтоконцентрацию ионов ацетата в среде поддерживают равной 1,5 вес. /о, а рН среды 7,0 - 65 85.