416958

,о,оее 49увтеиттф ф1,1-, А о п и чОЮе изоьеетения 416958 Союз Советских Социалистических РеспубликК ПАТЕНТУ Зависимый от патентаЗаявлено 02.И 1.1969 (Эй 1344878/28-13)Приоритет 02 Х 11.1968,45608/68, Япония М. Кл. С 12 д 13/10 ГОсударственный камитетСавета Иинистрае СССРие делам нзааретенийи аткрытий УДК 577,15.07(088.8) Опубликовано 25.11,1974, Бюллетень М 7 Дата опубликоьания описания 06 Л 111.1974 Авторыизобретения Иностранцы Дзинносуке Абе, Тецуо Ватанабе, Канго Мияути,Тосихару Нито, Цутому Ямагути и Нориюки Муроя(Япония) Иностранная фирма Тойо Джозо Кабусики КайшаЗаявитель СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПАЗЫ Изобретение относится к ферментной промышленности, а именно к способу получения липазы.Известен способ получения липазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углеводов, азота и жиры, например оливковое, рапсовое, соевое масла, в присутствии минеральных солей с последующим выделением липазы из культуральной жидкости.Предлагаемый способ позволяет расширить ассортимент применяемых продуцснтон.Для этого в качестве продуцента используют бактерии рода СЬготпоЬасепцтп изсоз 11 п 1 или СЬгогпоЬас 1 епцгп чо 1 асецтп. Предлагаемый способ заключается в следующем.Бактерии СЬгогпоЬас 1 ег 1 цгп лзсозцпт илиГЬготпоЬас 1 ег 1 цгп ио 1 асецтп выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и жиры в присутствии минеральных солей.В качестве источников углерода могут бытьиспользованы глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, растворимый крахмал, обычный крахмал, декстрин, меласса. В качестве источника азота может быть использовано любое подходящее азотсодержащее соединение, обычно используемое для этих целей, например измельченные соевые 5 бобы, обезжиренная мука из соевых бобов,мука из хлопковых семян, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, измельченные сухие дрожжи, мочевина, гидролизат казеина, соль аммония.10 В качестве минеральных солей применяютсоли ортофосфорной ислоты, например магниевые, кальциевые и калийные соли,В питательную среду вводят как растительные, так и животные жиры, такие как оливко вое, соевое, хлопковое масла, свиное сало,говяжий жир, сливочное масло.Жиры вводят в количестве равном 0,5 - 5%от веса культуральной среды.Выращивание продуцента можно произво дить как поверхностным, так и глубинным методом, но целесообразнее использовать последний.Выращивание осуществляют при температуре 24 - 28 С в течение 2 - 6 дней и при рН 25 6,0 - 7,0, установленном в начале процесса.Выделение и очистку лппазы производятобычным способом.25 3При использовании твердой среды липазу экстрагируют водой,При использовании жидкой среды из последней отделяют клетки, например фильтрованием под вакуумом или центрифугированием.1 олученный таким образом фильтрат или экстракт конденсируют или в него вводят осадители ферментов, такие как хлористый натрий, сульфат аммония или органические растворители, например этанол, ацетон.Фильтрат или конденсат можно высушивать распылением после введения в них стабилизаторов, например мальтодекстрина, лактозы, карбоксиметилцеллюлозы, полиэтиленгликоля, снятого молока, казеина, сорбита.Липаза, полученная предлагаемым способом, обладает стойкостью и активностью.11 осле выдерживания липазы при рН равном 4,0 - 9,0 в течение 24 час при температуре 20" С, остаточная активность ее составила 80%. Даже при р 11 равном 3,0 - 10,0 остаточная активность липазы составляет не менее 70%,Оптимальное действие липазы при рН равном 4,0 - 9,0 максимальное 6,0 - 7,0 при температуре 50" С.11 ример 1. В 100 мл стерильной жидкой питательной среды (рН 6,5), содержащей, %: свиного сала 2, крахмала 2, порошкообразных обезжиренных соевых бобов 2, (1 Н 4) 504 0,3, КНРО 4 0,2, СаСО, 0,5, Мд 504 7 Н,О 0,1, вносят С 1 тгогпоЬас 1 ег 1 цгп ч 1 зсозцгп чаг рага 11 р о 1 у 11 сцгп.Культивирование осуществляют при 26 С в течение четырех дней при непрерывном перемешивании.Затем отделяют мицелий и получают 75 мл фильтрата культуры.Активность фильтрата, определяемая методом, при котором в качестве субстрата используют свиное сало, составляет 11,5 ед/мл.К фильграту добавляют этанол до достижения концентрации спиртового раствора 75%.Таким образом, получили 3,43 г порошкообразной неочищенной липазы. Пр и мер 2. Полностью повторяют процесс, описанный в примере 1, но из питательной среды исключают свиное сало, В результате получают 26 г липазы.(Титр - 15 едг).П р и м е р 3, В 20 л стерильной жидкой среды (рН 6,5), содержащей, %: свиного сала 2, порошкообразных обезжиренных соевых бобов 2, (ХН 4),800,3, КН,РО 4 0,2, СаСО, 0,5, МАМБО, 7 НО 0,1 вводят 5 мл противопенного агента и засеивают микроорганизмами СйгогпоЬас 1 епцгп ч 1 зсозцгп чаг рага 11 ро 1 у 11 сцгп, предварительно культивируемыми в жидкой среде при 26 С в течение двух суток.Процесс выращивания осуществляют при 26 С в течение четырех дней при аэрации со скоростью 20 л в 1 мин и перемешивании мешалкой со скоростью 300 об/мин,30 35 40 45 50 55 60 б 5 Затем удаляют мицелий фильтрованием и получают 14,8 л фильтрата. Титр полученного фильтрата составляет 11,4 ед/мл.К фильтрату добавляют 490 г мальтодекстрина и высушивают (температура на входе 120 С, на выходе 70 С).Таким образом, получают 927 г неочищенной порошкообразной липазы, титр которой составляет 126 ед/г (определяют по методу, при котором в качеспве субстрата используют свиное сало).П р и м е р 3. Полностью повторяют процесс, описанный в примере 1, но в качестве продуцентов используют С 1 гогпоЬас 1 ег 1 цп 1 ч 1 зсовцгп ЛТСС 6918 и СйгогпоЬас 1 ег 1 цгп ч 101 асецгп ОТСС 12472.Получают соответственно 1,3 г порошкообразной липазы с активностью 38 ед и 1,5 г с титром 35 ед/г.Метод определения титра липазы.Состав реакционной смеси, млРаствор фермента 1 Фосфатный буфер(0)1 моль) рН - 7,0 5Эмульсия свиного сала 10 Эмульсию получают следующим образом: 20 г термически расплавленного сала добавляют к 10 мл твина 60 и 70 мл воды, полученную смесь центрифугируют со скоростью 11000 об/мин для гомогенизации.Реакционную смесь загружают в Г-образную пробирку и вибрируют с помощью взбалтывателя Моно при 40 С в течение 60 мин. Затем добавляют 30 мл смеси этанола и ацетона в соотношении 1: 1 для разрушения эмульсии. Титруют 0,05 н. раствором МаОН с применением в качестве индикатора 1%-ного раствора фенолфталеина.Такое же определение производят с денатурированным ферментом (предварительно обработанным при 100 С в течение 10 мин).Затем из первого результата титрования вычитают второй результат и разность, выраженная в расчете на 1 мл, представляет собой титр, который принимают за единицу на 1 мл.Характеристика продуцентов.Морфология, Палочка размером 0,6 - 1,2 мк. Споры не образуют, малоподвижны, грамотрицательные.Культуральные признаки. В качестве сред используют следующие: маннитнодрожжввчю, среду из дрожжевого экстракта и агара, глюкозопептонную, смесь картофельного экстракта и агара.Колонии на твердой питательной среде круглые, выпуклые, блестящие и вязкие, светло-желтовато-коричневого цвета. Пигмента не образует,Физиологическая характеристика.Оптимальные условия роста: рН среды 6,5, температура 26 С, аэробные.Биохимические признаки,Реакция на метил - красный отрицательная.416958 Составитель В. Дунье Редактор А. Вер Корректор В. Брыкснна Техред Г. Васильева Подписное Заказ 553/5 Р 1 зл, Лов 529 Тираж 456111 Р Государственного комитета Совета Министров СССРпо ледам изобретений п открытийМосква, Ж, Раушская паб., л.5 Типография, пр. Сапунова, 2 Реаиция Вожа - Проскауэра отрицательная.Индола не образует, сероводорода не выделяет, образует аммиак, нитраты восстанавливает, образует каталазу, желатину разжижает, крахмал не гидролизует, молоко не коагулирует, соли аммония и мочевины не уаваивает, метилен голубой не восстанавливает, лакмус восстанавливает, лимонную кислоту усваивает.Отношение к источникам углерода. Арабинозу, маннозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, сахарозу усваивает. Ксилозу, лактозу, мальтозу, раффинозу, сорбит, иннозит, глицерин,салицин, инулпн, декстрин, целлюлозу не усваивает. Предмет изобретения5 Способ получения липазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углеводов, азота и жиры, например оливковое, рапсовое, соевое масла, в присутствии минеральных солей с по следующим выделением липазы из культуральной жидкости, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве продуцента используют микроорганизмы СЪгопоЪас 1 егцп 1 с.зсозцгп или СЪгогпоЪас 1 епшп ло 1 асешп.