Способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде и устройство для его осуществления

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕ Н ИЯ,.(11) 624164 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 61) Дополнительное к авт, свид-ву22) Заявлено 22,03.77 (21) 2468148/28-1 51) М, Кл 1 Р 1 33/1 рисоединением заявкиГосударственний номитеСовета Министров СССРао делам изобретенийи открытий(45) Дата опубликовани А, А. Аревша Гальцова П. Ерохова, С, К. Манешин 72) Авторы изобретени и М, В, Кулако Московский ордена Трудового Красного Знамени институт химического машиностроения 1) Заявитель 4) С ОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ Э УБСТРАТА В ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ ДЛЯ ЕГО ОСУШЕСТВЛЕНИЯ ОГЕННОГОУСТРОЙСТВ 5 та иственхлорпровО проводить кретно, пу роорганиз ворителям тояния по Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в различных отраслях народного хозяйства, связанных с выращиванием микроорганизмов, предпочтительно дрожжей,Известен способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде, предусматривающий экстракцию субстрата из суспензии микроорганизмов растворителями с последующим спектрофотометрированием полученного экстракта в определяемойобласти спектра 1, 2.При определении субстрата из суспензии известными спирт-гексановым 1 и инфракрасным 2 спектрофотометрическим методами, основанными на экстракции субстраз суспензии микроорганизмов соответно спирт-гексановой смесью и четырех- истым углеродом, фотометрирование одят в инфракрасной области спектра.днако известные способы позволяютопределение субстрата только дистем экстракции из суспензии микмов различными токсичными расти без учета физиологического соспуляции микроорганизмов. 78,Бюллетень34 (53 УДК 663,576описания О г. 09. Б,.8 (088.8) Известен также способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов.Известно устройство для осуществленияуказанного способа определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде, содержащее измерительную и сравнительную камеры для анализируемой питательной среды, источник света, двухлучевую ос ветительную систему, обтюратор, фильтрывозбуждения и люминесценции и фоторегистрирующую систему с фотоумножителем 3.Этот известный способ и устройство дляего осуществления являются наиболее близкими к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату.Указанный способ не позволяет получатьнепрерывную информацию о физиологически необходимом содержании экзогенного субстрата в непрозрачной водной суспензии микроорганизмов по оксидоредукционным изменениям одного из компонентов дыхательной цепи митохондрий, а известное устройство для осуществления этого способа не обеспечивает получения непрерывной информации о характере исследуемой среды и не может быть использовано в непрерывном технологическом процессе, что в свою очередь не обеспечивает достаточно высокой производительности процесса культивирования и высокое качество биомассы.Целью изобретения является повышение производительности процесса культивирования и улучшение качества биомассы. 1 ОПоставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу определения содержания экзогенно го субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, исходную суспензию микроорганизмов облучают монохроматическим светом в интервале длин волн 330 - 370 нм и одновременно измеряют разность интенсив-.ности люминесценции окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида (НАД), содержащегося в клетках микроорганизмов, и в зависимости от получаемой величины по градуировочному графику определяют физиологически необходимое количество субстрата, вводимого в питательную среду при данной степени аэрации.При этом устройство для осуществления предлагаемого способа снабжено емкостью с барботирующим приспособлением и подводящими трубопроводами для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящими трубопроводами, один из которых сообщает емкость со сравнительной камерой, а два других осуществляют слив отработанной суспензии, при этом измерительная камера соединена подводящим трубопроводом с источником снабжения анализируемой среды.Кроме того, для повышения точности измерений измерительная и сравнительная 4 в камеры, фотоумножитель, а также фильтры осветительной и фоторегистрирующей систем размещены на интегрирующей сфере,На фиг. 1 изображена схема устройства для осуществления способа определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде; на фиг. 2 - график зависимости между содержанием парафина в среде (С ) и величиной разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной формы НАД - (Ь 1) .Устройство для осуществления предлагаемого способа (фиг. 1) содержит источник 1 света (ртутно-кварцевую лампу, двух- лучевую осветительную систему 2, обтюратор 3, а также фильтр 4 возбуждения, измерительную и сравнительную камеры 5 и 6 и фильтр 7 люминесценции, размещенные на интегрирующей сфере 8, и фоторегистрирующую систему. фоторегистрирующая система содержит фотоумножитель 9, усилитель 10, синхронный детектор 11, дифференциальный усилитель 12 и регистрирующий прибор 3.В устройстве имеется емкость 14 с барботирующим приспособлением 15, подводящие трубопроводы 16 и 1 для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящие трубопроводы 18, 19.Отводящий трубопровод 18 сообщает емкость со сравнительной камерой 6, а отводящие трубопроводы 19 осуществляют слив отработанной суспензии.Измерительная камера 5 соединена подводящим трубопроводом 20 с источником снабжения анализируемой среды (на чертеже не показан),При определении экзогенного субстрата в питательной среде с помощью указанного устройства исходную суспензию дрожжей из ферментера пропускают через проточные светоизолированные измерительную и сравнительную камеры 5 и 6, причем перед подачей суспензии в сравнительную камеру 6 ее пропускают через емкость 14, где осуществляют ее барботаж окислителем (кислородом воздуха) для полного окисления внутри- клеточного НАД. С помощью двухлучевой оптической системы 2 формируют два световых модулированных монохроматических потока возбуждающего излучения, которыми поочередно облучают камеры 5 и 6. Возникающие при этом световые импульсы, обусловленные люминесценцией среды, воспринимаются фотоумножителем 9, располокенным в отверстии сферы 8 перпендикулярно направлению возбуждающего излучения. УзкополосныЙ фильтр 7 выделяет вторичное излучение - люминесценцию на заданной длине волны в интервале 430 - 470 нм, фотоумножитель 9 при этом регистрирует монохроматическое излучение один раз от измерительной камеры 5 и второй раз от сравнительной 6, Последовательность импульсов усиливается усилителем 1 О и поступает на вход синхронного детектора 11, который обеспечивает разделение сигналов люминесценции от двух камер и преобразование их в уровни напряжения, соответственно пропорциональные этим сигналам. Два уровня напряжения поступают на вход дифференциального усилителя 12. Сигнал на его выходе пропорционален разности этих двух уровней или жеразностилюминесценцпи от двух камер 5 и 6, и регистрирующий прибор 13 обеспечивает непрерывную запись этого сигнала.При выращивании дрожжей рода Сапд 1- да дш 1 еггпопб исследуют влияние различных концентраций экзогенного субстрата-парафина на изменение разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной форм НАД. Дрожжи выращиваФормула изобретения 40 45 50 55 ют в 30 л ферментере при температуре 32 - 34 С. и рН 4,0 - 4,2 на синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника углерода парафины, а в качестве источника калия; магния, цинка, марганца, железа, фосфораих минеральные соли при степени аэрации 1200 об/мин мешалки. Концентрацию парафина в среде изменяют в диапазоне от 8 до 0,1 ггл. Контроль за содержанием парафина в среде осугцествляют спектрофотометрическим методом. По результатам полученных испытаний строят график (фиг. 2).Как видно на графике, существует обратно пропорциональная зависимость между содержанием парафина в среде (Ср) и в еличиной разности интенсивности флуоресценции восстановленной и окисленной форм НАД (Ь 1 ). Следует также, что при увеличении концентрации парафина выше 6 г(л нри данной степени аэрации дрожжи не могут окислить полностью субстрат, что приводит к накоплению его в клетках микроорганизмов и ухудшению кацества продукта с одновременным снижением скорости роста микроорганизмов. Предварительно построенный градуировочный график обеспецивает определение физиологически необходимогс колнцества субстрата в суспензии следующим образом. Суспензию микроорганизмов с концентрацией сухих веществ не выше 26 г/л наливают в измерительную кювету, которую помегцают в светоизолированную камеру прибора, облуцают с помошью ртутной лампы монохроматическим светом и измеряют интенсивность флуорссценции в области 430470 нм. Во вторую сравнительную камеру помешают такую же суспензию, но предварительно ггробарботированную, которую также облуцают монохроматическим светом и измеряют интенсивность флуоресценции в области 430470 нм. При этом сле гует следить, чтобы суспензия не расслаивалась. Построив график зависимости Л, от С .,определяют участок, где клегки могут потреблять добавляемый субстрат, и уровень насышения,т. е. количество субстрата, физиологически необходимое и цстатоцное для нормального метаболизма клеток. По показаниям регистрируюшего прибора и абсолютно сухому весу микроорганизмов в суспензии определяют нормированную величину интенсивности флуоресиенпии НАД, по которой с помошью калибровочного графика определяют физиологически неооходнмое содержание субстрата в среде.При этом разность люминесценции восстановленного (изгнерительная камера) и окисленного (сравнительная камера) никоти нагчндадениндинуклеотида составляет 4,5 мв нри концентрации аосолютно сухих дрож.кей 5 г/л. Величина интенсивности лк)чинесценции в пересцете на единицу аб 5 1 О 15 20 25 30 35 солютно сухих дрожжей равна 0,3 мв на 1 г/л относительных единицах) .С помощью калибровочной шкалы регистрирующего прибора определяют концентрацию субстрата в среде, которая равна для данного конкретного случая 0,8 г/л. Согласно калибровочному графику данная концентрация ниже функционально необходимой для клеток, поэтому для оптимального ведения процесса биосинтеза содержание парафина в среде надо увеличить до 6 г/л (см. фиг. 1), что соответствует максимальным физиологическим потребностям клетки.Таким образом, предлагаемый способ определения физиологически необходимого содержания экзогенного субстрата и устройство для его реализации позволяют не только быстро и с достаточной точностью (до + 5 ОО) контролировать содержание субстрата в среде, но и с учетом физиологического состояния популяции микроорганизмов, определяемого по оксидоредукционным изменениям внутриклеточного фермента НАД, регулировать в зависимости от степени аэрации содержание субстрата в среде, необходимое для обеспечения максимальной скорости роста микроорганизмов и улучшения качества продуктов, т,е. предлагаемый способ и устройство позволяют вести процесс в онтимальных условиях.Технико-экономический эффект при использовании предлагаемого способа и устройства для его выполнения создается благодаря ведению процесса при оптимальных условиях с получением продукта высокого качества, экономии сырья и точного и объективного измерения содержания субстрата в суспензии микроорганизмов. 1. Способ определения содержания экзогенного субстрата в питательной среде при непрерывном культивировании микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса культивирования и улучшения качества биомассы, исходную суспензию микроорганизмов облуцают монохроматическим светом в интервале длин волн 330 - 370 нм и одновременно измеряют разность интенсивностей лгомишесценцин окисленной и восстановленной форм никотннамидадениндинуклеотида, содержащегося в клетках микроорганизмов, и в зависимости от полученной величины по градуировоцному графику определяют физиологически необходимое количество субстрата, вводимого в питательную среду при данной степени аэрации.2. Устройство для осушествления способа по п. 1, содержащее измерительную и сравнительную камеры для анализнрования624164 рений, измерительная и сравнительная камеры, фотоумножитель, а также фильтры осветительной и фоторегистрирующей систем размещены на интегрирующей сфере.5 1. Санин П. И Ципугина Н. Н., Сучкова А, А., Сущик Р. Я. Микробиологическая 1 О промышленность,1, 1972, с. 38 - 40. А,7 ЦНИИПИ Заказ 5175/35Филиал ППП Патент, г. Уж ираж 2 Подннсно ород, ул. Проектная, 4 питательной среды, источник света, двухлучевую осветительную систему, обтюр втор, фильтры возбуждения и люминесценции и фоторегистрирующую систему с фотоумножителем, отличающееся тем, что оно снабжено емкостью с барботирующим приспособ пением и подводящими трубопроводами для ввода анализируемой питательной среды и окислителя, а также отводящими трубопроводами, один из которых сообщает емкость со сравнительной камерой, а два других осущест вляют слив отработанной суспензии, при этом измерительная камера соединена подводящим трубопроводом с источником снабжения анализируемой среды.3. Устройство по п. 2, отличающееся тем, что с целью повышения точности измеИсточники информации, принятые во внимание при экспертизе: 2. Андреев Н. С., Сидорова И, П., Найдин А, В, Микробиологическая промышленность,4 197 б, с. 14 - 17.3, Патент США3249754,кл. 250 - 83.3, 1966,