Питательный агар для кровяных сред

ур ф 4;.г СОЮЗ ССИЕ 1 с.,К 1/1 ХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1)5 С 12 11 1/20, С 12 САН И Е И ЗОБ РЕТЕ Н И Я": микробиология, стрептококк, пневя палочка. Сущность пол ьзова ни ьная среда гемофильн ения: пита я лаборавеществ ее ельная основ ие компонен ее соотношесреды; Фермо-костногонатрия4,5-5,5; агаированная шов Ц нта ныи гидюленя 1ожжевой12-13; Тцге МеР68 ССР1986.-20;экарша тальное, рН повысить част б. реда позвс ия иикроорфическимитабл. о,у,измов от больн болеваниями лег о окоысоко из и мофил основыаров ьнь х па кжевы,титуим.Г слож н ные средысодержат к к миГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(56) ТЬе Охо 1 с 1 Г 1 апва 1 ой Сцс 1 да, 1902 В 1 оос 1 Лцас. ВазеАвторское свидетельство1," 1402616, кл. С 12 И 1/20,Вишнякова Л.А.,и др. - Л1981, Г 1, с. 38-41,Изобретение относится к обл медицины и монет быть использо для приготовления кровяного и ладного агаров при выделении в требовательных микроорганизмов тологического материала, таких стрептококки, пневмококки и ге ные палоцки.Известны сухие питательные для кровяного и шоколадного аг производства зарубежных фирмАах Вазе фирмы "СхЬсо" В 1 оос 1 Вазе 112 Фирмы "ОхоЫ", специал основы для выделения геиофильн лоцек ("ОхоЫ" "11 егс 1 с") а та отечественные питательные осно выпускаемые в жидком виде (Инс эпидемиологии и микробиологии малеи АИН СССР).Однако перечисленпо составу, так как 5 Ц 1778181 А 1) ПИТАТЕЛЬНЫЙ АГАР ДЛЯ КРОВЯН(57) Ис питател мо кок к, изобрет следующ на 1 л зат ияс хлорид стра кт дистилл ф 0,2. С выделен неспеци ких. 5 нимуи два ферментативных белковых гидролизата, например мяса и печени("ОхоЫ"), мяса и бычьих сердец (основа ВНИИП), а также ингредиенты, усложняющие рецептуру (никотиновая кислота, растворииый крахмал, глюкоза, бактериологицеский активированный уголь специальной очистки).Прототипом является среда ВНИИП, имеющая следующий состав на 100 млсреды: агар-агар - 1,8-2,0 г, гидролизат по Хоттингеру или гидролизат казеина (180-200 мг.4 аиинного азота) - 70-75 ил, гидролизат бычьих сердец (140-160 мг.3 аминного азота)- 20-25 мл. дефибринированная кровь лошади - 4-5 мл, экстракт пекарских дрожжей - 0,5-0,7 мл. К недостаткам среды следует отнести наличие в ее составе двух ферментативных гидролизатов, нестандартность исходного сы 1778181рья и, следовательно, нестандартностьголуцаемых готовых сред более низкаяпо сравнению с предлагаемой основой,чувствительность среды в отношениивыделяемых из патологического материала высокотребовательных микроорганизмов - стрептококков, пневмококкови гемофильных палочек.1 ель изобретения - упрощение состава, повышение чувствительности идифференциально-диагностических,свойств среды. Поставленная цель достигается тем, цто предлагаемый питательный агар для кровяных сред содержит питательную основу, представляющую собой ферментативный гидролизатмясо-костного Фарша тюленя, а такнехлорид натрия, дрожневой экстракт,агар-агар при следующих соотношениях Окомпонентов, г на 1 л среды:ферментативный гидролизат мясо-костногофарша тюленя 18-20Хлорид натрия 4,5-5,5Дрожжевой экстракт ч,5-5,5Агар-агар 12-13Вода дистиллированная ОстальноерН 7,М 0,2Предложение соответствует критериюЗО"существенные отлиция", т.к. не обнаружены техницеские решения, содержащие признаки, сходные с отлицительными признаками предложенного объекта,целью выявления оптимального соотношения компонентов при конструировании питательной среды были опробованы различные ее варианты. Оптимальными концентрациями хлорида натрия идрожневого экстракта оказались концентрации, принятые в аналогичных г.,прописях. Количество в прописи питательной основы существенно влияло наростовые свойства тест-штаммов Бсг.Ьаено 1 уь.сив, Бгг.рпеппюп 3.ае и Н.п-К 1 вепгае. Данные приведены в табл, 1и 2. Основным критерием оценки качества среды являлась ее чувствительность в отношении тест-штаммов припосеве методом разведений.50Принимая во внимание даннныетабл, 1 и 2 можно сказать, цто оптимальной концентрацией гидролизата мясо-костного фарша тюленя является концентрация.18-20 г/л среды, обес 55 пецивающая содержание в среде 80100 мг.4 аминного азота, так как при этих концентрациях достигается максимальная чувствительность в отношениитест-итаммов Бгг.Ьаено 1 у:1 спв и Бсг.рпецпоп 1 ае. При повышении концентрации аминного азота от 100 до 130 мг.3чувствительность среды снижается(табл. 1), однако при дальнейшем повышении концентрации аминного азота(140-180 мг.Г) чувствительность средыв отношении тест-штаммов Бг.йэепо 1 у.сия и Бгг,рпецгпоп 1 ае вновь повышается и становится такой же, как при80-100 мг.3 аминного азота, Оптимальной концентрацией аминного азота всреде при культивировании тест-штамма Н. ьпг 1 цепгае является концентрация80110 мг." что также обеспечиваетсясодержанием 18-20 г основы в литоесреды (табл. 2). При этих концентрациях достигается максимальная чувст-,вительность (10 ) плотной среды ивырастает наибольшее количество колоний при посеве 100 микробных клеток(23,6-25). При дальнейшем повышенииколицества сухой основы - фермента"тивного гидролизата мясо-костногофарша тюленя, наблюдается снижениечувствительности среды. и уменьшениеколицества колоний, вырастающих припосеве 100 микробных клеток. При концентрациях аминного азота 180200 мг.3 тест "штамм Н, ЫГ 1 пепгае приразведениях 10 не дает видимых колоний,При изучении качества предлагаемого питательного агара для кровяныхсред по выделению патогенной флоры измокроты больных неспецифицескими заболеваниями легких применяли методколицественного посева (10 -10 ).Контрольными средами в этих опытахбыли кровяной и шоколадный агары нагидролизате Хоттингера производстваИнститута эпидемиологии и микробиологии им.Гамалеи. В качестве селективного агента при выделении гемофильной флоры был использован антибиотик бацитрацин, который добавлялся к готовому шоколадному агару притемпературе 50-60 С в количестве10 мг на 1 литр среды.1Идентификацию выросших микроорганизмов проводили по культуральным иморфологицеским свойствам, чувствительности к оптохину и лизису желчьюдля пневмококка. Идентификацию гемофильных палочек, выраставших на селективном шоколадном агаре, осуществляли на основании культуральных,Предлагаемая основа удобна в хрэ" нении и транспортировке, так как может выпускаться в сухом виде.П р и и е р 1, Для приготовления 1000 мл питательного агара навеску 18 г Ферментативного гидролизата мясо-костного Фарша тюленя, ,5 г дрожжевого экстракта, ч,5 г хлорида натрия и 12 г агар-агара растворяют в небольшом количестве горячей дистиллированной воды, доводят объем дистиллированной водой до 1 л, кипятят 1-2 мин, не допуская пригорания агара, Фильтруют через ватно-марлевый 1 морФол ич яких " биохимических свойств (каталазнал, оксидазная, уреазная, нитратредуктазная активность, ферментация углеводов), Результаты выделения патогенной Флоры от больных представлены в табл. 3 и Как видно из таблиц, предлагаемаясреда по сравнению со средой-прототипом является более чувствительной,так как на ней вырастает в большемчисле случаев и большее число колоний ЯСт,рпеишоп 1 ае и Н.1 пГ 1 пепгае припосеве этиологически значимых разведений патологического материала.Предлагаемая среда является болеепростой по составу, на ней в большейстепени выражены диФФеренциально-диагностические свойства микроорганизмов. Предлагаемая основа для кровяныхсред стандартна, что доказано авт.св,Г 1102616, тогда как в прототипе используется нестандартная среда из мяса сельскохозяйственных животных, Упрощение достигается тем, что вместодвух мясных гидролизатов (мяса и бычьих сердец) используется один гидролизат мясо-костного Фарша,Кроме того, предлагаемый агар для кровяных сред более экономичен, так как содержит 80- 100 мг.ь аминного азота вместо испопьзуемых в среде" прототипе 180-200 мг.3, что уменьшает себестоимость предлагаемой основы.Использование предлагаемой основы, высокочувствительнай в отношении ЯСт.рпецтчоп 1 ае и Б.1 пй 1 цепгае в сре- дах для кровяного и шоколадного агаров позволяет повысить частоту выделения этих микроорганизмов из мокроты больных неспециФическими заболеваниями легких, как это видно ,из табл. 5. 8180Фильтр, устанавливают рИ 7,6 с помощью 20" раствс ра едког о патра и разливают в стерильные Флаконы по 300. 350 мл стерилизуют автоклавированием при 121 С в течение 30 линут,Для приготовления кровяного или шоколадного агара к охлажденной до 50"Ссреде добавляют соответственно 54или 103 цитратной донорской крови,выдерживают при температуре 80 С втечение 5 мин в случае приготовленияшоколадного агара, перемешивают иразливают в чашки ПетриЧувствительность среды определяют,высевая по 0,1 мл приготовленной суспензии тест-штампов Ясг,Ьаево 1 ус 1 сця,БСг,рпецнопае, Н.1 пГ 1.вепгае из разведений 10- - 10 8 стандарта мутности щ 10 ед. параллельно на кровяной агарХоттингера (среду-прототип) и предлагаемую среду, церез ч 8 часов инкубации подсчитывают и описывают выросшиеколонии, готовят мазки, окрашивают по р 5 Гоаму, в случае пневмококка и гемоФильной палочки дополнительно окрашивают по Гинсу, ставят биохимическиереакции.На кровяном агаре с преллагаемойосновой.Ьпег 1 о 1 усспя рос в видеблестящих "мелких (1-1,5 мм в диаметре) полупрозрачных колоний, сохраняясвои тинкториальные свойства и морФологию. Колонии Бг.Ьаено 1 у 1 сия накровяном агаре с предлагаемой основучд вои давали более выраженные и ольшего диаметра зоны гемолиза, ч.насреде-прототипе. Яст,Ьаело 1 а 1 сия,выращенный на питательной среде спредлагаемой основой, сохранял свои 4 О ферментативные свойства; расщеплялсалицин, сахарозу и лактозу, рос набульоне с кислым значением рН ,85,обладал Фибринолитической активностью.Колонии тест-штамма Я.к,рпеппкп 1 аена кровяном агаре с предлагаемой основой вырастали более крупными с более выраженными зонами зеленящеголизиса.50 Тест-шталм Н. пК 1 иепгае на шоколадном агаре с предлагаемой основойрос в виде крупных слизистых колонийс характерным запахом. Размер выраставших колоний.(2-3 мм) был значи тельно больше, чем на контрольнойсреде с гидролизатом Хоттингера (среда-прототип).П р и м е р 2, Для приготовления1000 мл питательного кровяного ягора77820 г берл 1 ентативного гидролизата мясо-костного Фарша тюленя, 5,5 г дрожжевого экстракта, 5,5 г хлористогонатрия и 3 г агар-агара растворяютв небольшом количестве горячей дис 5тиллированной воды, доводят обьемсреды до 1 л дистиллированной водой,кипятят 1-2 мин, Фильтруют через ватно-марлевый Фильтр, устанавливают 10рН 7,6 с помощью 20 раствора едкогонатра и разливают в стерильные флаконы по 300-350 мл, стерилизуют авто клавированием при 121 С в течение30 мин, К охлажденной до 50 С средедобавляют 53 цитратной донорской крови, перемешивают и разливают в чашкиПетри. Полученный кровяной агар использовали для посева мокроты больныхнеспецифическими заболеваниями легких,Как видно из данных, представленных в табл. 3, при количественном засеве патологического материала 0,1 млиз 1 О -10разведений мокроты), 25предлагаемая среда является болеечувствительной по сравнению со средой-прототипом, так как на ней вырас-,тает на 1-2 порядка больше Бйг.рпецщоп 1 ае. ЗО 35 Формула изобретения П р и м е р 3. для приготовления 1000 мл селектипного шоколадного агара 19 г Ферментативногб гидролизата мясо-костного Фарша тюленя, 5. г дрожжевого экстракта, 5 г хпрристого натрия и 12,1 г агар-агара растворяют в небольшом количестве горячей дистиллированной воды, доводят объем среды до 1 л дистиллированной водой, кипя-. тят 1-2 минуты до полного растворения агара, Фильтруют через ватно,",марлевый Фильтр, устанавливают рИ 7,6 с помощью 20", раствора едкого натра и разливают в стерильные Флаконы по 300-350 мл, стерилизуют автоклавированием при 121 С в течение 30 мин. К охлажденной до 60 С среде добавляют 10/ цитратной донорской крови, выдерживают при температуре 80 С в течениео5 мин при постоянном помешивании охолаждают до 60 С, добавляют 1 О мг бацитрацина и разливают в чашки Петри, Полученный шоколадный селективный агар использовали для выделения пред" ставителей рода НаегпорЬ 11 ця из мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких, Как видно из табл.при количественном засеве патологического материала (0,1 мл 1 О -10разведений исходной мокроты), предлагаемая среда является более чувствительной по сравнению со средой-прототипом, так как на ней в большем числеслучаев и на 1-2 порядка больше вырастает. представителей рода НаеворЬ 1 -1 цв.;Как видно из приведенных примеров,предлагаемый питательный агар дпякровяных спед является более чувствительным и более. простым по составу,обладает улучшенными дифференциальнодиагностическими свойствами и экономически более выгоден, так как содержание аминного азота в среде с использованием предлагаемой основы может быть уменьшено в 2 раза. Для ееприготовления используется непищевоестандартное сырье - отходы зверобойного промысла,Использование предлагаемого пита, тельного агара для кровяных сред позволяет повысить частоту выделения от.больных неспецифическими заболеваниями легких ССгер 1 ососсцз рпецшоп 1 ае на16,233 и НаепюрЬ 1 цз 1 пЕ 1 цепгае на32,353, он более удобен в хранении итранспортировке, так как может выпускаться в сухом виде. Питательный агар для кровяных сред, содержащий белковый гидролизат, хлорид натрия, дрожжевой экстракт, а Гэр а Гар и дистиллирОВд нную Воду.о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения состава и повышения чувствительности и дифференциально- . диагностических свойств среды, из белковых гидролизатов он содержит Ферментативный. гидролизат мясокостного Фарша тюленя при следующем соотношении компонентов, г/л;Ферментативный гидролизат мясокостногоФарша тюленя 18-20Хлорид натрия 4,5-5,5 Дрожжевой экстракт 4,5-5,5 Агар-агар 12-13Листиллированная вода Остальное рН средь, 7 2 71 О Табли ца 1Чувствительность плотной среды в отношенИИ тест-штаммов БГг.Ьаено 1 ут сцен и Бгг. рпеитпоп ае в за висимости от содержания аминного азота в среде 7788 10 61 О1 О1 О 130 40 7,0 12,6 10,6 Чувствительность среды в отношении Содержаниеаминногоазота, мг.,150 160 10Бгг.йаено 1 у- Бгг,рпецпю-гсиз п 1 еа 180 101 О 50 60 190 200 70 90100 110 120 130 140 Анализ 150 160 180 на предлагаемой среде на контрольной среде 3,0 101,2 1 О3,5 10 3,0 1 О 2,4108 1,7 10 5,0 10 4,8 10 6,0 10 1,210 3 2.10 Та бли ца 2 Рост тест- штамма Б. жНпеп аае 8143 на плотной среде в зависимости от содержания аминного азота,8 93 ,0 т рост нет роста нет роста 1 О 1,5 10 2,010 25,0 24,05 24,0 44 45 нет роста нет роста 0 23,6 21,6 0 10 10 О 6 1 О 1 О 10 10 1 О 10 1 О 10 10 10 15101 0-1020101010251 О101030101 О Продолжение табл. 2 2 Табли ца 3Сравнительные результаты роста Бг.г.рпеипопае на экспериментальной и контрольной средах при посеве мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких количество выросших ко- лоний 2,4 1 О 1,0 10 2,010 2,5 10 5,0 1 О 1,0в1778181 1 1Табл и цаСравнительные результаты роста представителей рода Наетчор 1111 ив на экспериментальной и контрольной средах при посеве мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких Количество выросших колонийлнализ на предлагаемойсреде на контрольной среде 2,0 101077,0 1 О1,0 102,0101,0 101,0101,5 101,0105,6 102,1 108,01081,7 10 2,0 10нет роста 1005 1017 1090 нет роста5,0 107 1112 нет роста нет роста нет роста нет роста 1124 1176 1 182 1200 нет роста1 О 1206 2,0 1212 нет роста10 1246 1,2 1252 нет роста Та бли ца Частота выделения Ясг.рпецвопае и Н.пй 1 цепгае из мокроты больных неспецифическими заболеваниями легких на экспериментальной и контрольной средахМикроорганизм Количество образцов патологическогоматериала предлагаемая среда средапрототип 68 (58,123) 87 (74,353) 20 (29 41 о) 42 (61 761) Бг.рпецпопаеН.п 1 Г 1 цепяае Составитель Н.КозловаРедактор Л.Павлова Техред И.Иоргентал Корректор С,Оско Заказ 4165 Тираж ПодписноеВНИИЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн Г 1(НТ СССР 113035, 11 осква, Ж, Гаушская наб., д. б/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10