Способ получения пептидов

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУСоюз Советских Социалистических РеспубликЗависимое от авт. свидетельстваЗаявлено 25.1 т/,1968 ( 1236778/23-4)с присоединением заявкиКл. 12 МПК С Комитет по делам обретений и открытий ри Совете Министров СССРОпубликовано 12.И 1.1969. Бюллетень2Дата опубликования описания 15.1.1970 Авторыизобретен Власов и А, Ю. Били иститут высокомолекулярных соединении вител СПОСОБ ПОЛУЧ ПЕПТИДО Известен способ получения пептидов на сшитом полистироле, несущем гидроксильные группы.После снятия защиты с аминогруппы в случае синтеза пептидов на полимере присоединение следующих аминокислот достигается с помощью методов смешанных ангидридов, карбодиимидов и активирован 1 ных эфиров. Снятие полученных пептидов достигается омылением сложноэфирной овязи или действием бромистого водорода. Недостатками известных до сих пор способов синтеза пептидов на полимере является то, что, во-первых, такие полимерные носители необходимо специально готовить, во-вторых, ограниченная проницаемость сшитых полистиролов с,ростом длины синтезируемого,пептида приводит к пропускам в цепи синтезируемого пептида и, в-третьих, емкость этих носителей не удаегся,поднять выше 0,5 - 0,7 мг экв/г, с целью устранения указанных недостатков,в предлагаемом способе используются легкодоступные гидроксилсодержащие полимеры, а именно сшитые декстраны - липофилыные сефадексы марки Ни сефадексы марки Ст, предварительно модифицированные,Модификацию сефадексов марки 6 осущ твляют обработкой их хлорангидридо и-бромметилбензойной кислоты при нагрев нии до 90 С в инертном растворителе в присутствии основания,Присоединяют первую кислоту нагреванием соответствующего модифицированного сефадекса Ст с триэтиламинной солью трет-бутилоксикарбонил ВОС-аминокислоты в инертном растворителе.при 80 С в течение нескольких часов в,присутствии основания. В случаеиспользования сефадексаНпервую кис 10 лоту присоединяют с помощью карбонилдиимидазола при комнатной температуре с помощью смешанных ангидридов или хлоран,гпдридного метода с использованием имидхлоридов.15 Снятие трет-бутилоксикарбонильной защиты (ВОС) как в случае сефадексов б, так ив случае сефадекса гНосуществляют об,работкой сефадекса с присоединенной аминокислотой действием безводной трифторуксус 20 ной кислоты. Присоединение последующихаминокислот осуществляют с,помощью активированных эфиров ВОС-аминокислот.Снятие, пептидов с полимера осуществляютомылением сложноэфирной группировки,при2 комнатной температуре с помощью 1 н. 1 х 1 аОН,или гидразинолизом. Емкость полученных полимерных носителей определяют после присоединения первой аминокислоты по привесуили по содержанию азота. В случае применезО ния сефадексаНи карбонилдиимидазо 250153ла емкость носителя7,0 мг экв/г.Преимущесгвом новых полимерных носителей для синтеза пептидов является:1. Высокая емкость полимерных носителей, значительно превышающая емкость известных,2, Хорошая набухаемость сефадексов и высокая проницаемость их для молекул растворителя и реагентов, что значительно снижаетвероятность пропусков в цепи синтезируемого 5 10,пептида. В случае синтеза тетра- и пентапептидов получены электфоретически однородныепептиды.3. Доступность полимерных носителей, 15П р и м е р 1, Синтез дипептида - карбобензоксиглицилЭЬ-аланина с использованием модифицированного сефадекса 6-25.А. М о д и ф и к а ци я с е ф а д е к с а.0,7 г сефадекса С 1-25 обрабатывают, раствором 207,0 г хлорангидрида и-бромметилбензоинойкислоты в 1 О мл диметилформамида (ДРОФА)и 1,4,кл триэтиламина (ГЭА), Смесь греютна водяной бане лри 80 - 90" С в течение4 час. Полимер отфильтровывают, моют 25Д.1 ФА, диоксаном, водой, этанолом и эфиром,сушат над РО.- в,вакууме.,В. П р и с о е д и н е н и е В О С - ГУ. 1. -а л а н и н а. 0,86 г модифицированного сефадекса,присыпают к раствору 1,2 г З 0(0,0063 моль) триэтиламина в 10 мл абсолютного этилацетата. Смесь кипятят 12 час с об,ратным холодильником, полимер фильтруют,промывают (см. выше), сушат над РО;. З 5В, Снятие защитной группыи синтез дипептида, 081 г полученного выше сефадекса с присоединенным ВОС-ТЬ-аланином обраоатывают 20 мл безводнойтрифторуксусной кислоты. Через 1 час полимер фильтруютпромывают диоксаном, водойи заливают 20 мл 5/,-ного раствора бикарбоната натрия. Через 30 мин полимер отфильтровывают, моют водой, этаиолом, эфиром изаливают раствором 1 г оксисукцинимидного 45эфира карбобензоксиглицина в 5 мл диоксанаи 5 мл воды. Через 12 час полимер отфильтровываютпромывают (см. выше) и сушат в вакууме над Р 05.1, Снятие пептида с полимера. 0,8 г сефадекса с присоединенным к нему дипептидом обрабатывают 5 мл 1 н. МаОН.Через 1 час,полимер отфильтровывают, тщательно промывают водой и водные вытяжкиподкисляют 5 н. соляной кислотой. Водный 55раствор экстрагируют этилацетатом. Экстрактсушат над сульфатом магния. Г 1 осле отгонкирастворителя пептид перекристаллизовываютиз воды. Выход карбобензоксиглицилЭЬ-аланина 0,116 г, что соответствует емкости 000,59 мг экв/г; т. пл, 182 в 1 С. Пептидэлектрофоретически и хром атографически однороден.П р и м е р 2, Синтез пентапептида - карбобензокси.-лейцил.-аланил - 1. - валил.- 65 фенилаланилглицина с использованием сефадекса 1.Н, 5,2 г (0,03 моль) ВОС-гли-ОН и 5,0 г (0,03 моль) карбонилдиимидазола растворяют в 20 мл ДМФА, Через 20 мин к полученному раствору присыпают 3 г сефадекса 1.Н. Смесь оставляют при комнатной температуре,на 20 час, полимер отфильтровывают и промывают (см, выше).Вес сефадекса 1.Нс присоединенным ВОС-гли равен 4,1 г. Снятие защитной группы с аминогруппы и присоединение других аминокислот осуществляют по обычной методике (см. выше), После обычного снятия,пептида с 2,3 г сефадекса, к которому присоединен пентапептидполучают 0,9 г карбобензокси-Ь-лейцил-Ь-аланил-Ь-валил - Ь - фенилаланилглицина, что соответствует емкости 1,2 мг экв/г; т.,пл, 240 - 242 С,П р и м е р 3, Получение тетрапептида - кар бобензоксиглицил-Ь-лейцил-Ь - пропил-Ь- -фенилаланин с,помощью сефадекса 1.Н, Синтез пептида проводят аналогично примеру 2,Емкость носителя после снятия тетрапептида равна 1,3 мг экв/г, т,пл. 101 С. Пептид электрофоретически однороден,П р и м е р 4, Получение карбобензокси,глицилгидразида с использованием сефадекса 1.Н,А. П,р и с о е д и н е н и е, кар б об ензокси-кбз-г л и ц и н а к с еф а д е кс у 1.Н, 7,0 г кбз-гли-ОН (0,033 моль) и 5,5 г (0,033 моль) карбонилдиимидазола растворяют в 10 мл ДМФА. Через 30 мин к этому раствору присыпают 2,5 г сефадекса 1.Н. Через 24 час полимер отфильтровывают и промывают (см, выше),Вес сефадекса с присоединенным карбобензоксиглицином 5,9 г, что соответствует емкости 7,0 мг экв/г,Б, С н я т и е,к а р б о б е н з о к с иглицина с сефадекса ЬН 20 с пом ощь ю гидр азина. Получение кар б о б енз о кс игл ицил гидр а и д а. 2,0 г сефадекса 1.Нс присоединенным кар бобензоксиглицином заливают 8 мл 50/-ного гидразина, через 48 час отфильтровывают полимер, промывают горячим этанолом, после отгонки этанола получают 1,1 г гидразида карбобензоксиглицина; т. лл, 115 - 116 С, что соответствует емкости 7,0 мг экв/г. Предмет изобретения1. Способ получения пептидов на полимерном носителе, с,присоединением первой аминокислоты к носителю известным способом, отличающийся тем, что, с целью аовышения выхода пептидов с весовой единицы носителя и устранения пропусков в цепи синтезируемых пептидов, в качестве носителя используют сефадекс марки 1.Н или предварительно модифицированный сефадекс марки б,250153 Составитель А. АкимоваТехред Л. К. Малова Корректор А. С, Колабин Редактор Е. Хорина Заказ 3544/11 Тираж 480 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква Ж, Раушская наб., д, 4/5 Типография, пр, Сапунова, 2 2. Способ по п, 1, отличающийся тем, что сефадекс марки 6 модифицируют обработкой хлорангидридом п-бромметилбензойной кислоты при нагревании до 90 С,3, Способ по п, 1, отличающийся тем, что первую аминокислоту присоединяют к сефадексу марки 1.Н с помощью карбонилдиимидазола.4. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем,что первую аминокислоту присоединяют,к се фадексу марки б длительным нагреваниемдо80 С в присутствии основания.