Способ определения супероксидустраняющей активности

(21 (22 (46 ТИя, биотехнолоенерируют суксиламина в щей визуализас тринитросивеличине ивности судят остей опытной,С, Лиси.Ч Е. ч ау из егохЫ В 1 осЬе з 1 р до аз В Р ержащего 1% ки реакции изых и холостой щая (Еуперок- рассчитываетнтрольной и 7,4, со оста но в опыт страняю ивностьЕ 560 ко трис-НС 1 буфера, рН тритона Х, После меряется экстинкция пробах. Супероксиду сиддисмутазная) акт ся по отношению опытной проб Изобретение относится к биохимии имо 1 жет быть использовано для определениясубероксидустраняющей (СУА) или суперокси)тдусмутазноиСОД) активности.Цель изобретения - ускорение и упрощ ние процесса определения СУА,Способ осуществляют следующим образо),В пробирки, помещенные в любое термсстатирующее устройство (т = 30 С) вносятнеобходимый объем (0,1 М) карбонатногобуфера, рН = 10,2 с 1 мМ ЭДТА и 24 мкМТНСТ, Затем в опытные пробирки вносятис)следуемые образцы в 0,1 М карбонатномбуфере с 1 мМ ЭДТА, в контрольную (холост ю) пробу - равный объем буфера. Реакц ю запускают добавлениемги роксиламина до концентрации 1 мМ, одн временно в холостой и опытных пробах, Через 5 минут после запуска (т,к. эа это время достигается экстинкция 0.2) реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 1 М) К, Нуапд пмазе аз 1 охЫе оз зи тее. - Апа 80-287, 2,Капо,е 1 пд аптохЫ ау аког ырег сЬев апб 89-195. зи, С, Яорегохбе пд ака 11 йе опоту е ап)оп депе 1 абопоп и), 1983, ч,135, М 2,егат 1 оп о 1 ырегох 1 с 1 е гавса т 1 оп о 1 Ьубгох 1 агп 1 па апб хЫе 01 зптотазе. АгсЬ 1 чез о 1 1 орЬуз., 1978, ч.186, М 1,.Ж, 17933(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТРАНЯЮЩЕЙ АКТИВНОС (57) Использование: биохими гия. Сущность изобретения: пероксид реакций гидро щелочной среде с последую цией путем взаимодействия ним тетразолия. О супероксидустраняющей акт по разнице оптических плотн и контрольной проб, 2 табл. ЕСУА =2 Еббогде СУА - супероксидустраняющая активность в единицах;Е 56 О - Е 56 О кснтральнай прабы;Е 560 - Е 560 опытной пробы,П р и м е р 1, Исследовали СУА аминокислоты цистина.Для определения СУА в 19 пробирках,помещенных на водяную баню (ВБ) при т30 С, вносили по 1 мл 0,1 М Г 4 а - карбонатного буфера рН = 10,2 с 1 мМ ЭДТА и 22 мкМТИСТ(Буфер А). Затем в пробирки добавили1793375 Таблица 1 30 Супероксидустраняющая активность цистина (Расчет по значениям Е 560)540 мМ раствор цистина в буфере А до необходимой концентрации с учетом последующего разбавления. СУА всех опытных проб и в контроле 1 (холостая проба) определяли в 3-х повторностях. Все пробы доводили до объема 1,8 мл буфером А. Для запуска реакции в пробирки с-интервалом 3 с. вводили по 0,2 мл 0,10 мМ раствора гидроксиламина в дистиллированой воде. Через 5 мин реакцию генерации супероксид-аниона останавливали при достижений зкстинкции 0,2 добавлением в каждую пробирку 0,5 мл 1 М трис НС буфера, рН 7,4 с 1 о , тритона Х. Останавливающий буфер добавляли также с интервалом 3 с для того, чтобы время генерации для всех пробирок было одинаковым, Экстинкцию (Е 560) проб определяли при помощи СФ, СУА расчитывали по формулекЕ 5602 Е 560В таблице 1 приведены значения Е 560 для всех 19 проб.Из табл. 1 видно, что цистин проявляет СУА, увеличиватощуюся с увеличением его концентрации,Формула изобретения Способ определения супероксидустраняющей активности, включающий введение анализируемого образца в реакционную смесь, содержащую 0,1 М карбонатный буфер с рН 10,2, тринитросиний тетразолий 1 мМ, ЭДТА 1 мМ и гидроксиламин 1 мМ с последующим инкубированием и измерением оптической плотности, по величине котоВремя определения СУА в 19 опытныхпробах 10 мин в контроле 2 определениеСУА одной пробы занимает 15 мин (способпрототип),5 Данные по СУА цистина приведены втабл, 2,П р и м е р 2, Аналогично примеру 1исследовали СУА аминокислоты гистидина,Данные приведены в табл.2."0 П р и м е р 3. Аналогично примеру 1исследовали СУА аминокислоты метионина.Данные приведены в табл.2,Из табл.2 видно, что все исследованныеаминокислоты проявляют СУА, увеличиваю 15 щуюся с увеличением концентрации аминокислоты.Данные, полученные при помощи обоихспособов, достоверно не отличались. 20 Таким образом, предложенный способпозволяет значительно упростить и ускорить в 3-12 раз определение СУА за счет введения опытного образца до запуска генерации супероксид-аниона и останови ге нерации субстрата в процессеопределения. рои оценивают супероксидустраняющую активность, отл ича ю щи йся тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, гидроксиламин вводят в реакционную смесь после анализируемого образца, инкубируют реакционную смесь и реакцию останавливают при достижении экстинкции 0,2 добавлением 0,5 объема 1 М трис-НС буфера с рН 7,4, содержащего 1 тритона Х.+0.09 олз о,ог 0.530,040,56чО.05 т 0,56 фО, 0,50 о.о 0.52Ю.ог0.52ОО 2 тионин о,оз0,42 о.оз нтроль Составитель С, ХализовТехред М.Моргентал орректор Н, Корол акт За аз 502 ВНИИПИ ГоТираж твенного комитет 113035. Москва, Подписноезобретениям и открытиям при ГКНТ СССРРаущская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 0,90