Способ получения пироглутамилсодержащих субстратов

(51)5 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ Б,Слиеде,рисутст- цинимипособыутамилнсациитрипсислучатьыходом, ф в проых протоящих,ы способы полученижащих ферментных сенсации Вос-замеще пироглустратовой -пиГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Рижский политехнический институт им. А.Я.Пельше(56) Авторское свидетельство СССР В 1025091, кл. С 07 К 5/00, 1984,Авторское свидетельство СССР ч. 1198082, кл. С 07 К 5/00, 1984.Ещвчака К. и др, Мед с)гоео 9 епс апс Гиого 9 епс зцЬИгатз аког Руггоакопу Рер 1(азе. -3, Вос)ел. 1978, 83, 1145-1149. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРОГЛУТАМИЛСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ (57) Использование: в медицинской и биологической химии. Сущность: способ получения пироглутамилсодержащих ферментных субстратов общей формулы Изобретение относится к усовершенствованному способу получения пироглутамилсодержащих субстратов, которые находят применение в медицинской биологической химии,Известно несколько способов синтеза и-нитроанилидов пироглутамилсодержащих субстратов. Их получают конденсацией пироглутамилпептида с и-нитроанилидом аминокислоты,Известен способ получения пироглутамилпептидов методом активированных эфиров с использованием пентафторфенилового или Й-оксисукцинимидного эфиров, Конденсация пироглутамилпептида с и-нитроанилидом аминокислоты проведена с Й,М -дициклоЬ С"р Ий С СН С ИОгИСН= СН- Сигде Я-Н, -РЬе, -РЬе-Аа. -Аа-Аа- е 0. Реагент 1: хлорангидрид-пироглутаминовой кислоты, полученный непосредственно перед введением в реакцию обработкой :пироглутаминовой кислоты пятихлористым фосфором при температуре -5-10 С в абсолютном хлорированном углеводороде: , Реагент 2;Щч н-с =" Ск-с-ЙО.2СН=СК-СНПроцесс ведут в присутствии основания с последующей выдержкой в течение 16 ч. Предпочтительно при получении соединений , где.А=Н, в качестве основания используют избыточное количество п-нитроанилина, Выход 70-95. 1 з,п, ф-лы, 2 табл. гексилкарбодиимидом, иногда в и вии одного эквивалента й-оксисук да.Известны ферментативные с получения и-нитроанилидов пирогл содержащих субстратов путем конд фрагментов с использованием химо на и термолизина.Эти способы не позволяют и продукты с достаточно вйсоким в они не удобны для использования мышленности при крупномасштабн изводствах и требуют дорогос реактивов.Известн я тамилсодер уб путем конд нн50 55 роглутаминовой кислоты с и-нитроанилидбм в присутствии конденсирующего агента ДЦК) при 0 С с последующей выдержкой при комнатной температуре,Недостаток известного способа. состоит в том, что в нем используют защищенную по аминогруппе пироглутаминовую кислоту, дициклогексилкарбодиимид (сильный аллерген), кроме того при осуществлении известного способа требуется дополнительная стадия - отщепление защитной группы. Выход целевого продукта невысок и составляет 170.Недостатком известных способов является использование в синтезе И-защищенных производных пироглутаминовой кислоты.Цель описываемого способа - повышение выхода пироглутамилсодержащих ферментных субстратов и упрощение процесса.Поставленная цель достигается описываемым способом, в котором хлорангидрид 1-пироглутаминовой кислоты полученный непосредственно перед введением в реакцию обработкой 1-пироглутаминовой кислоты пятихлористым фосфором при температуре -5 - 10 С в абсолютном хлорированном углеводороде, вводят во взаимодействие с азотсодержащим ароматическим нитросоединением формулы д-ХН Я.ВОе, где А=Н, Р 11 е-РЬе-Аа, 1:Аа 2- -Аа- -ео и процесс ведут в присутствии основания с последующей выдержкой в течение 16 часов, предпочтительно при А=Н в качестве основания использовать избыточное количество п-нитроанилида,Способ осуществляют следующим образом.Индивидуальность полученных соединений установлена методом ТХС на пластинках е 8 иапо" в системах; этанол-н-бутанол-вода = 1;4;1 (А); пиридинн-бутанол-вода-уксусная кислота =20:30:12:6 (Б); н-бутанол-уксусная кислота- вода = 200;35;70 (В).К суспензии 18,1 г (87 ммоль) пентахлорида фосфора в 150 мл абсолютного хлорированного углеводорода (метиленхлорид, хлороформ) порциями добавляют 10,2 г (79 ммоль)-пироглутаминовой кислоты, под- держВваМ 1 емпературу реакционной смеси -5-10 С, При данной температуре перемешиваеотл еще 1 ч. Расотворитель отсасывают. Прибавляют 79 ммоль и-нитроанилида ами.нокислоты или пептида, или и-йитроанилина и 79 ммоль основания х (триэтиламин, пиридин, Й-метилморфолин) в абсолютном 5 10 15 20 25 30 35 40 неполярном растворителе (тетрагидрофуран, диоксан). Прибавление ведет при температуре -5-10 С, затем перемешивают 2 чпри той же температуре, и оставляют на .16-20 ч при температуре 18-20 С. Растворительупаривают в вакууме водоструйного насоса (температура бани 40 С), остатокобрабатывают 1 н. раствором соляной кислоты, отфильтровывают и на фильтре промывают водой. При перекристаллизации изспирта получают соответственный пироглутамилсубстрат,Выходы и свойства полученных соединений даны в табл,1,При использовании и-нитроанилинадля синтеза и-нитроанилина :пироглутаминовой кислоты прибавление основания нетребуется,По сравнению с известными способамиполучения пироглутамилсодержащих фер- .ментных субстратов преимущество предлокенного способа характеризуется тем, чтопо одной общей унифицированной схемеможно синтезировать любой представителькласса пироглутамилсодержащих ферментных субстратов. Это позволяет провестисинтез выше названных соединений в одинаковых технологических условиях,Кроме того, предложенный способ позволяет исключить работу с сильным аллергеном М,й-дициклогексилкарбодиимидом,который используется в известных способахдля конденсации пироглутамилпептида с инитроанилидом аминокислоты,Для осуществления предложенногоспособа не требуется дефицитные и дорогостоящие ферментные препараты (химотрипсин, термолизин), которые используются визвестных сйособах для синтеза препаративных количеств некоторых пироглутамилпептидов.Формула изобретения1, Способ получения пироглутамилсодержащих субстратов общей формулы где В-Н,-РЬе-, -:РЬе-Аа, -:Аа-Аа- еи,путем взаимодействия производного - пироглутаминовой кислоты с соответствующим азотсодержащим ароматическим нитросоединением вабсолютномнеполярном органическом растворителе при пониженной температуре с последующей выдержкой при комнатной температуре, о тл ича ю щи йс я тем,что, сцельюупрощения процесса и повышения выхода, в качестве производного-пироглутаминовой кислоты используют хлорангидрид-пироглутаминовой кислоты, полученный непос1781226 2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что при А-Н в качестве основания используют избыточное количество и-нитроднилина,Таблица Синтезированные соединения, (номер) Т.пл ССпиртдлякристаллизации г Известныйспособ Нредлагае- Известныйиый способ способ Предлагае- Известныйиыи способ способ Нредлагаеиый способ Ь-С 1 р-РНА-16(с "0,5ДИФД) Таблица 2 Составитель И.РавиняТехред М.Моргентал Корректор С.Юско Редактор Заказ 4252 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 редственно перед введением в реакцию обработкой :пироглутаминовой кислоты пятихлористым фосфором при температуре (-5)+10)РС в абсолютном хлорированном углеводороде, в качестве азотсодержащего ароматического нитросоединения - соединение общей формулыЛ-ЫН.Я,где А-Н, 1:Ре, -1 -РЬе-Аа, -1: - Аа-Аа.ец,и процесс ведут в присутствии основания с последующей выдержкой в течение16 ч.5