Способ получения аденозин-5 -трифосфата, меченного изотопами фосфора в -положении

СОЮЗ СОВЕ ГСКИХСОЦИАЛИС ИЧЕСКИХРЕСПБЛИК(.О О ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОЛЛИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВ ГОРСКОМУ СВИДЕП:ЛЬСТВ(71) Хозрасчетное опытное предприятие"Радиопрепарат" Института ядерной физии АН УЗССР, Институт почвоведения и фотосинтеза А 1-1 СССРС. О 1 зпцта 1 оп геастопз о пцс 1 еозс 1 еро 1 урЬозрЬатез, 11, Брес 111 с сЬегпсазупйезз о 1 Го - апс у 2 Р-пцс 1 еоз 1 ое 5-тгрЬозр 1 атез. //. Агп, С 1 егп, Яос. - 1965,У, 87, Мо. 10. - Р. 2265 - 2277.Туманов О.В . Гришаев У,П Рукавишников У.О Аммосов А.ДПортянко А.П.Химический синтез ( у- Р) АТР, Тезисы3докл, 11 Всесоозного совещания по проблеме. Эизиологически активные соединения,меченые радиоактивными и стабильнымиизотопами, У 1988, с, 63.С 11 упп .УСЬарре 11 .В, А з 1 гпр 1 е гпейосаког Йе ргерагатоп о РаЬе 1 ес ас 1 епоз 1 пе, 32тгрЬозрЬэте чл 1 тЬ Ьцп зресйс аститу,//.1,Во 1. СЬегп, 1973, У, 248, Ио, 23. - Р. 8319 - 8321,ЯэзетЬ Т.Р.оЬпзоп Я,А. ТЬе еп 2 угпатсргерагат оп о 1 / йР/ пцс 1 еоз 1 сетг 12 о 1 озр 11 атез, сус 1 с / Р/ АУР, эпс сусс32(57) Использование: в качестве ради тивной метки в биохимических и мол лярно-биологических исследовани Сущность изобретения: продукт: ад зин-( у- Р)-трифосфат, выход 90 95%. Реагент 1: хлоропласты расте (гороха), реагент 2: фетэзинметасуль или 1-метокси-метилфеназинмегас фат, или пиоцианин. Условия реакстзии; облучении УФ ь присутствии Н 3 РИзобретение относится к биохимии и может быть использовано для получения аденозин-( ), 32133)Р)-т 13 ифосфэтэ у 32(33) Р)АТР) который широко применяется в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях,Известны различные способы получения ( )/-1 Р)АТР; химические, ферментэ 32 33)тивные, Как правило, все современные методы дают высокие (более 90 Я выходы целевого продукта, Однако, прэкгически во всех случаях используотся достаточно сложные реакционные смеси, зэтрудняющие очистку продукта реакции,Наиболее близким по техническому ре:зению является способ получения (у - Р) Р, описанный Авроном. Метод основан нэ использовании фотозависимого синтеза АГР 3 хлоропластах растений, Реакционная сме" ь содержит всего несколько компонентов, причем один из них хлороплэстыдостаточно просто удаляется из реакционной смеси путем обычного центрифугирования. Дальнейшая очистка полученного. таким образом ( у- Р)АТР значительно упрощается. Однако, метод гозволяет получать продукт с выходом не более 75 ф от исходного Р и применим лишь для получе 32ния небольших порций радиоактивного продукта. Это обусловлено тем, что в качестве кофактора реакции использовали ферри 1.1 иэнид, Известно, что фотссинтетическая электронтранспортная цеь(ЭТЦ), раббота которой обеспечивает энергией синтез АТР, включает две фотореакции, так называемые фото- системы 1 и 2.Аппара фотосистемы 2, основной функцией которого является фотсразложение воды, имеет лабильну о структуру. Вследствие этого полная ЗТЦ хлоропластов легко повреждается, При использовании феррицианида в качестве акцептора электронов донором электронов является йода, то есть работает полная ЭТЦ. Низкая эффективность работы ЗТЦ с этим кофактором не позволяе получить подукт с вьоссдом более 750 даже при лаоораторном масштабе производства(порядка 1 мКи). При промышленном синтезе ( у(33 АТР, использующем 100 мКи Р хлоропласты с феррициэнидом32практически не работают,Целью изсбуетения является повышение выхода( у- ( )Р)АТР,Цель достигается тем, что в способе получения( - ( Р)АТР, с использованием хлоропластов растений за счет энергии света, в качестве кофактора реакции фосфорилирования применяют феназинметасульфэт или его производные,5 10 15 20 25 30 35 40 50 55 Работу фотосистемы 2 в Э ГЦ хлоропластов можно шунтировать, если использоватьв ка гестве кофакторэ фенэзинмегасульфат,выполняющий одновременно функцио донора и акцептора электронов фотосистемы 1,Аппарат фотосистемы 1 существенно болеестабилен, чем аппарат фотосистелю 2,Экспериментально обнаружено, что использование о качестве кофактора реакциифеназинметэсульфата позволило увеличитьвыход- РАТР до 90 Я, и более от уров 32133ня исходного Рл Очень важно, что такой33выход продукта можно получить при использовании 100 мКи Рл т,е, в условиях про 32мышленного производства,П р и м е р 1, Использование в качествекофактора реакции феназинметасульфата,Хлоропласты выделяют из листьев гороха по ранее описанному методу, В выделенные хлоропласты добавляют глицерин до107,заморэживэют и храня 1 в жидком азоте, 100 мКи Рз" РО", в 100 мкл 0,04 М НС 1упаривэот нэ рогационном испарителе дляудаления соляной кислоты и рэстворяст в50 мкл дистиллированной воды, Реакционная смесь (общий обьем 100 мкл) содержала40 мМ трицинаОН, рН 7,5, 5 мМ М 9 С 12,10 мМ КС 1, 50 мкМ феназинметасульфат, 5мМ АДР, хлсроплэсты (30 мкГ хлорофилла),Реакционную смесь освещают лампой накаливания при освещенности 50000-100000Л,окс в гечение 10 мин, Выход реакции составляет 90-95";4 от исходной Н 3 РО" Реакционную .смесь центрифугируст 5 минпри 8000 хд, Г 1 олученный таким образом32(у- Р)АТР выделяют с использованием высокоэффективной хроматографии нэ хроматсгрэфе фирмы "1 КВ" (Швеция).П р и м е р 2. Использование в качествекофактора реакции 1-л 1 етакси-метилфеназинметасульфата. Процедуру г 1 олучения ивь 1 деления целевого продукта .осуществляют., как описано в примере 1 за исключением того, что вместо феназинметасульфатаиспользуют 5-метилфеназинметэсульфат вконцентрации 50 мкМ, Выход ( у - Р)АТРсоставлял 90-95П р и м е р 3, Использование в качествекофактора реакции пиоцианин, Процедуруполучения и выделения целевого продуктаосуществляют, как описано в примере 1 заисключением того, что вместо феназинметасульфата используют пиоцианин в концентрации 50 мкМ, Выход( уР)АТР составлял95 о"П р и м е р 4, Получение ( у- Р)АТР.Г 1 роцедуру получения осуществляют какоплсано в примере 1, за исключением того,что вместо 100 мКи Нз РО брали 30 мКи321768606 Составитель Л,ПанфиловаТехред М.Моргентал Корректор И,Шмакова Редактор Заказ 3620 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, К, Раушская наб 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Нз Р 01. Выход- Р)АТР составляет 90 -зз зз95 о/Использование описываемого способаобеспечивает по сравнению с известнымиряд преимуществ;увеличение выхода ( у- ( )Р)АТР до32(зз)90;4 и выше,обеспечение высокого выхода для получения больших порций радиоактивногопродукта, т,е, возможность использованияв промышленных условиях,а также упрощение синтеза,сокращение времени синтеза до 2-10мин при обеспечении при этом высокоговыхода,Способ опробован для получения( у - з Р)АТР в условиях промышленного производства при загрузкахдо 100 мКи радиоактивного сырья. Выход целевого соединения составляет более90,По сравнению с ранее используемойферментативной технологией получения5 (у -Р)АТР, предложенный способ позволяет сократить время синтеза с 40 - 60до 2 - 10 мин,Формула изобретения 10 Способ получения аденоэин-трифосфвта,меченного изотопами фосфора ву-положении фосфорилированием аденоэин-дифосфата хлоропластами хлоропластов растений эа счет энергии света и кофактора реакции фосфори лирования, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения выхода целевого продукта, в качестве кофактора реакции фосфорилирования применяют феназинметасульфат или его производные,