Способ генетической дактилоскопии

(5)5 ЗОБРЕТЕНИ ОПИСАН ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ,Хан(56)осег О.И/. ап( Ноо( О,Е. Епчгопщепта Неай Регзрессчеа, Еб Оепеча, 1987, ч, 76, р. 147 - 153. Изобретение относится к медицине, вчастности к медицинской генетике и судебной медицине,Известны следующие способы использования индивидуальных признаков человека: дактилоскопия, лабораторный анализестественных выделений человека (слюны,пота, спермы и т.д.), определение группыкрови и др. Однако перечисленными способами трудно определить происхождениетканей,и клеток, т.е, их принадлежность копределенному индивидуму или к определенному клону клеток человека, культивируемых и чтго.Наиболее близким к предлагаемому является способ определения генотипа подлине вариабельного тандемного повтора(ВТП), расположенного на 3 -м фланке протоонкогена НА-ВА 02 1 человека. Для,этогогеномную ДНК, гидролизованную ферментом Мзр , гибридизуют в,жестких условияхс 2 Р-ДНК-пробой, содержащей последоваГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(57), Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской генетике и судебной медицине, Целью изобретения является повышение чувствительности способа за счет использования маркеров, специфичных для каждого индивидуума в отдельности. В качестве генетических маркеров предлагается использовать не только величину ВТП, но и особенность распределения метильных групп на 5-м фланке протоонкогена НА-ВАЗ 1 в геноме людей. тельности протоонкогена НА-ВАЯ 1 человека (проба ДНК - Е 6.6), иметодом авторадиографии выявляют специфические рестрикционные фрагменты ДНК. Так было а установлено. 32 аллельных варианта прото онкогена НА-ВАЯ 1, которые присутствуют вд геноме людей разных этнических групп. Аллели А 1, А 2, АЗ и А 4 (часто встречающиеся) р обнаружены у 91,3 обследованных людей; А 1,2, А 1.1, А 4,1, А 0.1, А 1.3, А 1.4 и А 5 (средне встречающиеся) - у 5,6; остальные (ре- О дкие: А 3.2, А 2.2, А 2,3, А 2.4, А 3,1, АЗ,З, А 3.4, А 1.35, А 2.01, А 3,5, А 4.2, А 0.15, А 0.2, А 1.25,А 2,010, А 202, А 2,020, А 2,1, А 2,11, А 2.12, А А 5.2) - только у 3,1 людей, Диплоидный геном человека содержит два аллеля протоонкогена НА-ВАЯ 1, которые могут быть как равной длины (гомозиготный вариант), так и разной (гетерозиготный вариант), Таким образом, используя в качестве маркера длину ВТП НА-ВАЯ 1, всех людей можно разделить на 32 группы, что равно 1024, Посколькуаллели А 1, А 2, АЗ и А 4 встречаются чаще протоонкогена НА-ВАЯ 1, обусловленного всего, то в популяции людей превалирует индивидуальностью в распределении метолько 16(4 ) вариантов генотипа НА-ВАЯ 1, тильных групп у наружного цитозина в по- остальные же - значительно реже. Причем, следовательностях ЦЦГГ геномной ДНК, 61 людей содержит аллель А 1, 12% - А 2, 5 П р и м е р. Использование протоонко,7 - АЗ и 8,8, - А 4. Отсюда следует, что гена НА-ВАЯ 1 в изучении генотипа больных основной недостаток прототипа заключает- раком желудка.ся в том, что он позволяет разделить всех Для этого выделяли геномную ДНК из людей только на отдельные группы, по- . карцинов и неизмененной слизистой обоскольку сам генетический признак носит по лочки желудка, а также лейкоцитов крови пуляционный характер. больных. Кусочки ткани (1 г.) гомогенизируЦель изобретения - повышение чувст- ют в 10 мл ТМЕ-буфера (10 мл трисНС 1, рН вительности способа за счет использования 8,0, 0,15 М йаС 1, 1 мМ ЭДТА). Клетки гомо- маркеров, специфичных для каждого инди- гената лизируют прибавлением раствора15 ЯРЯ до конечной концентрации 1% и подСпособ заключается в том, что в качест- вергают фенольной экстракции в течение ве генетических маркеров предлагается ис мин при комнатной температуре при инпольэовать не только величийу ВТП, но и тенсивном перемешивании. Смесь центриособенность распределения метильных фугируютпри 2000910 мин при 4 С, Водную групп на 5-м фланке протоонкогена НА-ВАЯ 20 фазу забирают и повтбрно экстрагируют фе, Для этого геномную ДНК гидролизуют налом в том же режиме до исчезновения ферментом Мзр 1, гибридизуют в мягких ус- интерфазы (3 - 4 раза). Затем к водной фазе ловиях с пробой Е 6.6(онкогеном НА-ВАЯ прибавляют 2 объема этанола и получают 1) и выявляют рестрикционные фрагменты, осадок хромосомной ДНК, Хромосомную принадлежащие 3-му и 5-муфланкам про ДНК обмывают 70 о -ным этанолом и растоонкогена НА-ВАЯ 1. На 5-м фланке про- творяют в дистиллированной воде.тоонкогена НА-ВАЯ 1 имеется 32 участка, Концентрацию ДНК в растворе (мг/мл) узнаваемых ферментом Мзр 1. Эндонуклеа- определяют на спектрофотометре при за рестрикции Мзр узнает последователь- длине волны 260 нм.ность ЦЦГГ и не расщепляет ее, если 30 Венозную кровь(20 - 30 мл) больных нанаружный цитозин метилирован. Метилиро- сыщают гепарином (20 ед/мл), разбавляют вание цитозиновых оснований (Ц) на 5 -м 1/10 объема физиологическим раствором ио фланке протоонкогена НА-ВАЯ 1 имеет при- центрифугируют при 10009 10 мин при 4 С, , знаки индивидуальной специфичности и не Плазму удаляют, а лейкоцитарную пленкузависит от тканевой принадлежности кле используют для выделения ДНК по описанток. Кроме того, метильные группы у наруж- ной методике.ного цитозина в последовательностях ЦЦГГ К 10 мкгДНКприбавляют 50 едэндонукпротоонкогена НА-ВАЯ 1, которая сохраня- леазы рестрикции Мзр 1 и рестрикционный ется даже в ДНК злокачественных опухолей " буфер, Реакционную смесь инкубируют при и их метастазов, присутствуют с высокой 40 37 С в течение 10 - 16 ц при периодическом стабильностью. Достоверность результа- встряхивании пробирок. Для проверки качетов, полученных предлагаемым способом, ства используемого фермента параллельно достигается чрезвычайно низкой вероятно-с гидролизом основных препаратов ДНК вестью выявления одинаковой рестрикцион- дут энвиматическую фрагментацию ДНК фаной картины в ДНК разныхлюдей, Для 5-го 45 га А в тех же условиях.фланка протоонкогена НА-ЙАЯ 1 число воз- Гидролиз препаратов ДНК останавможных вариантов равно 32 (по ферменту ливают непосредственно перед элект 32Мзр 1) и 32 для 3-го фланка НА-ВАЯ 1 (по рофорезом, добавляя к ним 1/10 объема длине ВТП), т.е. всего 32 + 32 =10, В наслаивающего буфера, содержащего 70 оэтом уравнении второй показатель слева 50 глицерина, 0,5 бромфенолового синего и служит для сужения поиска до опреде,2 М ЭДТА, рН 8,0.ленной группы лиц, а первый - для не- Электрофорез гидролизованных препапосредственной идентификации объекта ратов ДНК ведут в 1,5 геле агарозы, приисследования по ийдивидуальному гене- готовленном на трис-ацетатном буфере (40 тическому признаку. Величина и число 55 мМтрисНО, рН 8,0,20 мМацетатайа,2 мМ дополнительных Мзр 1 - рестрикционных ЭДТА), Продолжительность электрофореза фрагментов, не нарушается даже вДНКзло- составляет 10 - 12 ч при напряжении электгкачественных опухолей и их метастаз, что рического поля 2 - 3 В/см, Для определения подтверждает стойкость выявленного гене- размеров рестрикционных фрагментов остического признака - ПДРФ 5-го фланка новных препаратов ДНК ведут параллельЗаказ 510 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская нэб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 1ный электрофорез ДНК фага А, гидролизованной ферментом Юпбили Рзт .После электрофореза гель агарозы окрашивают в растворе этидия бромида(1 мг/мл), фотографируют в УФ-свете и обрабатывают 0,25 М НС в течение 10 мин;.Затем гель помещают в прибор для переноса фрагментов ДНК на нейлоновые фильт;ры. Элюцию ДНК проводят в условиях 0,4М йаОН 12 - 16 ч. Фильтр споласкивают в 102-кратном ЯЯС (1-кратный ЯЯС содержит0,15 М йаС, 0,015 М цитрата йа, рН 7,0) иподсушивают на воздухе, Сухие фильтрыможно хранить между листами фильтровальной бумаги неограниченное время. 15Для выявления Мзр -рестрикционныхфрагментов протоонкогена НА-ВАЗ 1, нейлоновые фильтры, содержащие рестрицированную геномную ДНК, гибридизуют спробой Е 3 6.6, предварительно меченной 20радиоактивным фосфором ( Р-а ДЦТФ) вреакции ник-трансляции. Гибридизацию ведут 16-20 ч при 60-62 С в растворе следующего состава: 3-кратный ЯЯС, 0,1% БОЯ,0,5 мг/мл дрожжевой тРНК и 5-кратный 25реагент Денхардта (50-кратный реагентДенхардта содержит фикол, поливинилпирролидон, бычий сывороточный альбумин по5 гр на 500 мл Н 20), 30Отмывку фильтров от непрогибридизовавшейся пробы ДНК осуществляют в трех режимах: сперва при комнатной температуре в четырех сменах раствора 2-кратного ЯЯС и 0,1 ЯОЯ, затем при 37 С втечение 35 2 ч в четырех сменах того же раствора, после этого при 50 С в течение 2 ч в четырех сменах раствора 0,1-кратного ЯЯС и 0,10 ВОЯ,Отмытые фильтры сушат в термостате при37 С.Высушенные после гибридизации фильтры экспонируют на рентгеновской пленкев кассетах с усиливающими экранами в течение 3 - 10 сут.Продолжительность исследования составляет 15 дней.Как видно из примера. использованиепредлагаемого способа изучения генотипалюдей на основании особенностей структуры 3 и 5 фланков протоонкогена НА-РАЯ1 позволило разбить обследованных больных на 4 группы и выявить генетическиепризнаки, присущие каждому индивидуму вотдельности,Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет на генетическомуровне установить принадлежность ткани(клеток) определенному человеку; определить происхождение кусочков тканей иликлеток, принадлежат они одному лицу илиразным; проверить клональность популяции клеток в культуре и степень их,загрязнения клетками иного происхождения входе научных работ.Формула изобретенияСпособ генетической дактилоскопии,включающий определение генотипа подлине вариабел ьного тандемного повтора,расположенного на 3-м флэнке протоонкогена НА-ВАЯ 1 человека, о т л и,ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышениячувствительности способа за счет исполл ьзо ва ни я ма рк еров, специфичных для,каждого индивидуума, определяют распределение метильных групп на 5-м фланкепротоонкогена НА-РАЯ 1,