Способ получения рестриктазы в ai

(19 151)5 С 12 Й 9/14 ИЕ ИЗОБРЕТЕВИДЕТЕЛ ЬСТВУ Я ПИСА К АВТОРСКО ръфЕ ГОСУДАРСТВЕННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Институт биологической и медицинскойхимии АМН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫВЬчА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных и молекулярно-генетических.работах, Изобретение заключается в том,что продуцент В.Ьгечз ВКМ Ввыращивают на питательной среде, содержащей исИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-ин-. женерных и молекулярно-генетических работах,Эндонуклеазы рестрикции ( рестриктазыкласса) широко примеНяются в структурных исследованиях ДНК, конструи. ровании рекомбинантных молекул ДНКи. чтго, идентификации генетических .аномалий у человека и разработке подходов к диагностике наследственных заболеваний, во многих областях молекулярной биологии, биохимии, вирусологии и микробиологии; Обладая высокой специфичностью к узнаваемой и расщепляемой нуклеотидной после- я точники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса В.Ьгечз ВКМ содержит новую рестриктазу ВЬчА, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 5 6.ААХМ хПИТТС 31 в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах, Выход очищенного препарата рестриктазы ВЬчА составляет 1800 - 2200 ед активности на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции ВЬчА. не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонуклеаэУчитывая особенности локализации участка узнавания рестриктазы ВЬчА на векторных молекулах ДНК, новый фе мент может быть использован в биотехнол гических и молекулярно-генетическ работах,Идовательности ДНК, рестриктазы представ-; рляют удобную модель для изучения проблемы нуклеиново-белкового узнавания.Рестриктвве, вйделеннвя ив Хвптвовопввтвпргот 1 в 7 А 31, расщепляет ДНК. фага 2 в 24участках, ДН К Абг в пяти, ДН К 1 вх 174 в трех,плазмиду рВК 322 в двух и не гидролизует йДНК обезьянего вируса куЧ 40,Согласно предлагаемому способу продуцент ВасИцз Ьгечз ВКМвыращивают на питательной среде, содержащейисточники углерода, азота и минеральныесоли в условиях аэрации. целевой продуктвыделяют из полученной биомассы известными методами.Рестриктаза ВЬчА - изошизомер Хвп, узнает и расщепляет участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 ,СААМИ МЙТТСЗ. Фермент гидролизует ДН К фа- гаЛ по 24 участкам, ДНКАб 2 по пяти, ДНК 10 х 174 по трем, плазмиду рВВ 322 по двум и не имеет сайтов узнавания на ДНК обезьянего вируса ЪЧ 40.Поиск штамма-продуцента осуществляют с помощью разработанного экспресс-метода тестирования рестриктазной активности в. толуольных экстрактах из клеток микроорганизмов с последующим электрофоретическим анализом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле.Штамм Вас 111 цз Ьгеч 1 з 677 получен из Всесоюзной Коллекции микроорганизмов АН СССР; где хранится.под М ВКМ В-НСВ 8146 = АТСС 10068 (каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов) и не является идентичным описанным в литературе продуцентам рестриктаз ВЬч 1, ВЬчП и ВЬчЯ 1. Характеристика штамма.Морфологические особенности: подвижные палочки, грам-положительны (признак варьирует Грам Грам ).Культурально-биохимические свойства: на скошенном агаре рост по штриху нежный, мелкие, блестящие, гладкие колонии; на чашке Петри с мясо-пептонным агаром мелкие, блестящие, гладкие колонии; на мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера осадок,Отношение к кислороду - аэроб.Утилизация углеводов: на глюкозе, манните К - ,Индол и сероводород не образует, Желатина уколом - Разжижение.Чувствительность к антибиотикам: культура обладает множественной устойчивостью к антибиотикам; резистентна к пенициллину, канамицину, хлорамфениколу, оксациллину; чувствительна к стрептомицину, тетрациклину, неомицину, линкомицину, гентамицину,метициклину, нистатину.Оптимальные условия выращивания и хранения культуры.Культура В.Ьгеч 1 з ВКМхорошо растет в условиях аэрации при 370 С на бульоне Хоттингера с добавлением 2 глюкозы, а также на среде, содержащей в 1 л, г: дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; МагНРО 12 НгО 2,2; МаС 3; Мд 804 0,5; СаО 2 0,25, рН 7,2-7,5. Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды. Рабочие культуры пересевают на бульон Хоттингера один раз в 7-10 дней. Храняткультуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизированном виде5 в ампулах,Культура непатогенна для мышей.Инкубационная смесь для определенияактивности рестриктазы ВЬчА 1 объемом 40 -50 мкл содержит 0,05 М трис-НО, рН 7,5,10 0,01МдСг, 0,001 М, дитиотреитола, 0,1 ММаС 1,2 мкгДНКфагаЛи 0,5-10 мкл фермента, Инкубацию проводят при 37 С в течение60 мин. Продукты расщепления ДНКфага Лрестриктазой ВЬчА 1 определяют15 электрофоретически в 1,50 -ном агарозном геле с последующим прокрашиваниемгеля бромидом этидия. За единицу активности фермента принимают то минимальное количество его (в мкл), которое необходимо для20 полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л при37 С за 1 ч инкубации в стандартных условияхинкубационной смеси.П р и м е р 1, Культуру Васцз ЬгечзВКМпредварительно адаптируют в те 25 чение ночи при 37 С в условиях аэрации наосновной питательной среде, содержащей в1 л, г: дрожжевой экстракт 5; пептон 10;глюкоза 5; йа 2 НРО 4 12 Н 20 2,2; МаС 1 3;Мд 304 0,5; СаС 2 0,25, рН среды 7,2 - 7,5.30, Инокулят для ферментации готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 лсвежей среды из.расчета 1;10 и размножаютв условиях аэрацииФерментацию культуры проводят после35 добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при37 С с аэрацией, рН 7,2. - 7,5, Во времяферм ентации р Н кул ьтурал ьной жидкостиподдерживают в пределах 73 - 7,6.40 Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста.Выход сырой биомассы составляет 79 г/л культуральной жидкости,Содержание рестриктазы ВЬчА 1 в био 45 массе оценить не возможно, поскольку культура В.Ьгечз ВКМпродуцирует еще двеэндонуклеазы рестрикции ВЬчА 1 и ВЬчИ 1 соспецифичностью соответственно рестриктаз Оа 1 и ВзрМ 1.50Выделение,рестриктазы ВЬчА.10 г биомассы Вас 1 цз Ьгечз ВКМ суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуковой дезинтеграцией при 2-4 С, После удаления остатков55 клеточных оболочек и неразрушенных клеток с помощью ультрацентрифугированиябесклеточный экстракт обрабатывают полиэтиленимином, фракционируют сернокислым аммонием, сульфатаммониевую.1712415 Составитель И. ПриваловаРедактор Л. Пчолинская Техред М.Моргентал Корректор С. Шевкун Заказ 510 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 5 6фракцию диализуют и ведут последователь-. .Биомасса штамма Васоз Ьгечз ВКМно хроматографию на колонках с ДЗАЭ-цел-, 677 содержит зндонуклеазу рестрикциилюлозой (ДЕ, "Ватман" ) и голубой . ВЬчА, узнающую и расщепляющую нуклеосефарозой (фирмы "Фармация" ) и рехрома-тидную последовательность ДНК 5 ОААЙЙфтографию на ДЭАЭ-целлюлозе. 5 ИИТТС.З" в количествах, достаточных дляПолучают 22000 ед рестриктазы в 20 мл получения рестриктазы в препаративныхглицеринового буфера, Выход очищенного масштабах,препарата фермента 2200 ед на 1 г сырого Выход очищенного фермента ВЬчА совеса биомассы. Рестриктаза ВЬчА стабиль- ставляет 1800 - 2200 ед на 1 г сырой биомас-,но сохраняет активность в течение не менее 10 сы,6-8 мес при хранении при -20 С. Фер-: Зндонуклеаза рестрикции ВЬчА не сомент не содержит примесей фосфатаз, держит примесей неспецйфическихнуклеаз. неспецифических эндонуклеаз и экзонукле-., и фосфатаз.аз, пригоден для картирования ДНК и всех Уйитывая особенности локализацииучавидов генно-инженерных работ. 15 стка узнавания рестриктазы ВЬч на векторП р и м е р 2. Культивирование штамма ных молекулах ДНК, новый фермент можетВасцз Ьгечз ВКМпроводят аналогич- быть использован в биотехнологических ино примеру 1, за исключением того, что в молекулярно-генетических работахкачестве питательной среды используют мяЪсо пептонный бульон с 2% глюкозы, 20 Формула изобретенияВыход биомассы 6 - 7 г/л культуральной Способ получения рестриктазыжидкости. ВЬчА, заключающийся в культивироваПосле очистки фермента выход рестрик-, нии продуцирующего микроорганизматазы составляет 1800 ед/г биомассы, Васоз Ьгечз ВКМна питательной.Таким образом; по предлагаемому спо средесодержащей источники углерода,собу получают новую рестриктазу ВЬчА 1, . азота и минеральные соли, в условияхПоиск новой рестриктазы проведен пу- . аэрации с последующим выделением фертем скрининга у 70 штаммов бактерий рода мента и очисткой его хроматографией.Васцз,