Способ определения чистоты препаратов плазматических мембран клеток тканей лабораторных животных при отсутствии выраженной генетической патологии

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1709219 9) .Я Ц. ц 5 6 01 й ЗЗЛ)0 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ КОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ АВТО матиче- мбран- ервому(71) Институт радиобиологии АН БССР (72) В;А.Войткун, А.В.Житкович, А.А,Милютин, Е.Ф.Конопля и Л.М.Лобанок (53) 577.15.08 (088.8)(56) Мэдди 3. Биохимическое исследование мембран. М.: Мио, 1979. ч.1.Ясодарга 6., ОоЬосг ., Рап 1,РОеаи Е, Ап вргочес есбпцце аког ргерагатоп о 1 9(еетае вцзсе Се Разва вевЬгапе. - Воспвса ет В ормузса Асса, 1974, ч 345., М 3, р,348-358. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСТОТЫ ПРЕПАРАТОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБИзобретение относится к биохимии, вчастности к способам определения чистотымембранных препаратов. Известнь способы определения чистоты препаратов плазматических мембран путем измерения активности ряда ферментов. Известен также способ, который предусматривает использование нескольких ферментов для оценки чистоты плазматических мембран.Недостатками известных способов являются отсутствие универсального биохи мического маркера для саркоплазматического ретикулума, а также отсутствие интегрального показателя, характеризующего общую загрязненность плазматических мембран другими структурами клетки, т.е, сложность осуществления известного способа заключается в неооходимости измерения большого числа ферментов.Целью изобретения является упрощение способа.Способ заключается в том, что измеряют активности 5-нуклеотидазы и фумаратРАН КЛЕТОК ТКАНЕЙ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ОТСУТСТВИИ ВЫРАЖЕННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения чистоты мембранных препаратов. Целью изобретения является упрощение способа, Способ заключается в том, что измеряют активности 5-нуклеотидазы и фумарат-гидратазы, а при отношении обогащения 5-нуклеотидаэы к обогащению фумараэы по сравнению с первым супернатантом, равному 35 - 40, судят о достаточной чистоте выделенных плазматических мембран. 1 з.п, ф-лы, 1 табл., 1 ил,гидратазы (КФ 4.2.1.2), а при отношенииобогащения 5-нуклеотидазы к обогащениюфумаразы по сравнению с первым супернатантом, равному и более 35 - 40, судят одостаточной чистоте выделенных плазматических мембран,Способ осуществляют следующим образом.Исследуют только два фермента, одиниэ которых характеризует только количество плазматических мембран, а второй - всеостальные составляющие клетки (микросомы, цитозоль,митохондрии),Первым ферментом является 5-нуклеотидаэа, вторым - фумараза (фумарат-гидратаза),Для количественной характеристикистепени очистки плазматических мембранвводят коэффициентКф = Н(Ф,где Н - обогащение фермента плазских мембран (5-нуклеотидазы) в меной фракции по отношению к исупернатанту (гомогенату);30 Ф - обогащение фумарат-гидратазы поотношению к первому супернатанту.Для сравнения с известными методиками, характеризующими препараты плазматических мембран, используюткоэффициентНКсг= С +Ггде С -"обогащение фермента, присутствующего только в митохондриях (сукцинатдегидрогенаэа); Г - обогащение фермента,присутствующего только в микросомах(глюкоза-б-фосфатаза).На чертеже представлен график анализа препаратов плазматических мембран, загрязненных в различной степени,Анализ показывает, что зависимость Кфот Ксг линейна с коэффициентом 9 пропорциональности.Для определения границы достаточнойстепени чистоты мембранных препаратованализировали данные по выделению плаэматических мембран (см.таблицу).Расчет коэффициента Ксгподаннымлитературы показывает, что препараты плазматических мембран, используемые длябиохимических исследований, имеют Ксг вобласти выше 3, что соответствует коэффициенту Кф более 35-40, Таким образом, для. характеристики чистоты фракций плазматических мембран можно использовать измерение активности только двухферментов (5-нуклестидазы и фумарат-гидратазы) и считать полученные фракции препаратами плаэматических мембран.П р и м е р 1. Гомогенат ткани центрифугируют 1500 ц 10 мин, отбирают 1 млполученного супернатанта (1 СН) и продолжают выделение мембран по любой методивке. Измеряют активность 5 -нуклеотидазы в1 СН (53,6 нг Р/мг белка/ч) и в препаратевыделенных мембран (800 кг Р/мг белка/ч),Обогащение 5-нуклеотидазы составляет800:53,6 " 15, Измеряют удельную активность фумарат-гидратазы в 1 СН (12 нМ/мгбелка/ч) и в мембранном препарате(3,1 н М/мгбелка/ч), Обогащение этого фермента составляет 3,1:12,0 = 0,26. Рассчитывают коэффициент Кф = 15:0,26 = 58. Полученноезначение показывает, что такой препаратплазматических мембран может быть использован в любь 1 х биохимических исследованиях.П р и м е р 2, Удельная активность 5 нуклеотидазы в 1 СН и проверяемом препарате мембран составляет 75,4 и 997 нг Р/мг белка/ч соответственно. Обогащение этого фермента 997;75,4 - 13,2, Удельная активность фумарат-гидратэзы в 1 СН составила 12,0, а в мембранном препарате - 7,8 нМ/мг белка/ч. Обогащение фермента 7,8:12,0- =0,65. Рассчитывают коэффициент К 4 -13,2 : 0,06 "22,0. Такой препарат нельзя считать фракцией плаэматических мембран и использовать в биохимических иссле ованиП р и м е р 3, Удельная активность 5- нуклеотидазы в 1 СН и мембранном препарате составляет 85,7 и 1564 нг Р/мг белка/ч соответственно. Обогащение фермента 1564:85,4 = 18,2. Удельная активность фумарат-гидратаэы в этих препаратах 17,5 и 8,5. нМ/мг белка/ч, Обогащение фермента 8,5:17,5 " 0,49. Рассчитывают коэффициент Кф = 18,2;0,49 = 37, Такие препараты можно использовать для определения функционального состояния плазматических мембран, но не для измерения их количественного состава,Характерные соотношения активностей маркерных ферментов, получаемых при выделениях плаэматических мембран клеток, приведены в таблице. Формула изобретения 1. Способ определения чистоты препаратов плазматических мембран клеток тканей лабораторных животных при отсутствии выраженной генетической патологии, включающий измерение активностей 5-нуклеотидазы и маркерного фермента, характеризующего прочие компоненты клетки, и сравнение результатов измерений, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве маркерного фермента, характеризующего прочие компоненты клетки, используют фумарат-гидратазу. 2, Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что чистоту препаратов плаэматических мембран определяют по формуле Кф=-Н/Ф, где Н - обогащение 5-нуклеотидазы по отношению к исходному препарату; Ф - обогащение фумарат-гидратазы по отношению к исходному препарату, и при величине Кф; равной и более 35 - 40, судят о достаточной чистоте препарата плвзматических мембран,1709219 Составитель А. СеменовРедактор Ю. СередаТехред М.Моргентал Корректор Т. Пали аказ 421 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и откратиям при 113035, Москва, Ж-Зб, Раушская нвб., 4/б СССР оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 10