Способ определения адениловых нуклеотидов в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 9218 ЕСПУБЛИК 05 0 01 й 33/50 ОПИСАНИЕ ИЗО РЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ ЬСТВУЕНИЯ Ы относится к биому хозяйству и и ного кол ичесдениловых нукФ) в биологичес рганах и тканях нонафталини инкубирудансилхлорида (5-диметилами1-сульфонилхлорид), рН 10 - 12ют в темноте при 30 - 50 до . обесцвечивания, При этом образуются дансилированные производные адениловых нуклеотидов.Разделение смеси дансилированныхпроизводных осуществляется методом хроматографии в тонком слое силикагеля в системе диоксан-изопропанол-аммиак-вода (40:10;8:22). Количество содержащегося в пятне нуклеотида определяют по величине флуоресценции при облучении хроматограммы ультрафиолетовым светом, Интенсивность флоуресценции может быть измерена любым из способов: прямое сканирование хроматограммы на флуоресцентном спектрофотометре, злюция пятен в логии, ме- редназнатвенного леотидов их объекеловека и повыше- информамен ного в одной етения являетс ности способа счет одновр Ф, АДФ и АМФ ующим обрасоб осуществля(калибровочные ганов и тканей), уклеотиды, смеовым раствором ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения АН СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНИЛОВЫХ НУКЛ ЕОТИД 08 8 БИОЛОГИЧЕСКОММАТЕРИАЛЕ(57) Изобретение относится к области биохимии, медицинской биологии, медицины исельского хозяйства и предназначено дляточного количественного определения адениловых нуклеотидов в биологических объектах, в том числе органах и тканях человекаи животных. Целью изобретения являетсяповышение чувствительности, информативИзобретение дицине и сельско чено для точ определения а(АТФ, АДФ, АМ тах, в том числе о животных,Целью изоб ние чувствитель тивности эа определения АТ пробе, эом,Исследуемые образцы растворы, экстракты из ор содержащие адениловые н шивают с 0,5-ным. ацетон ности за счет одновременного определения АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе. экономичности. Цель изобретения достигается путем приготовления экстракта, проведения реакции дансилирования пробы с 0,5-ным ацетоновым раствором 5-диметиламинонафталин-сульфонилхлорида при соотношении воды и ацетона в реакционной смеси 1;1, рН 10 - 12 и инкубации в темноте при 30 - 40 С, хроматографическое разделение проводят в тонком слое силикагеля при использовании хроматографической смеси 1,4-диоксанизопропанол-аммиак-вода в соотношении 4 О:10:8:22, с последующим флуориметрическим определением количества аденидовых нуклеотидов после облучения хроматограммы ультрафиолетовым светом. Предлагаемый способ в 1000 раэ повышает чувствительность определения по сравнению с нефлуоресцентными аналогами. 6 табл.раствор с последующим измерением на спектрофлуориметре, фотографирование хроматограмм в ультрафиолетовом свете с измерением почернения на негативах с помощью просвечивающего микроденситометра. Чувствительность предлагаемого методасоставляет 0,5-1 х 10 нуклеотида-1 г .в пятне, что на 2 - 3 порядка виве, чем у прототипа, и равна наиболее широко используемому в настоящее время люциферазному.Это преимущество сочетается с возможностью одновременного определения трех аденилатов в одной пробе. Разработанные условия дансилирования являются избирательно оптимальными для адениловых нуклеотидов, что в сочетании с предлагаемой системой растворителей, дающей более качественное, чем прототип, разделение (й 1; АТФ-О,17; АДФ - 0,42; АМФ - 0,7), гарантирует специфичность идентификации и определения. Воспроизводимость метода составляет 93 - 95,Способ иллюстрируется следующими поимеоами,П р и м е р ", 10 мкл крови отбираю из 30 35 40 45 50 55 пальца человека или ушной вены свиньи и смешивают с 450 мкл раствора НС 10 до конечной 0,4 й концентрации, зкстрагируют в течение 25 мин на ледяной бане и цектрифугируют 3 мин при 15000 9, 200 мкл надосадочной жидкости нейтрализуют 2 М К 2 СОз и хранят в замороженном состоянии при -16 С до проведения анализа, Предварительно оттаянные и отцентрифугированные (16000 9, 3 мин) экстракты в обьеме 100 мкл смешивают с равным обьемам 0,50(,-ного ацетокового раствора даксилхлорида и 10 мкл ЗМ К 2 СОз, После инкубации в термостате (37"С в течение 2 ч) пробы (2,5 мкл) наносят на пластины "ЯЬ 1 о" (20 х х 20 см) и двукратно хроматографируют в смеси 1,4-диоксан-изопропанол-аммиа ".- вода (40:10:8;22 по объему), Высушенные хроматограммы фотографируют в ультрафиолетовом свете мокохроматорл КФ(СССР), Полученные негативы декситометрируют на микрофотометре МО"Каг Сегг", (ГДР) с интегратором, показания которого заранее калибруют по стандартным растворам аденилатов,Для определения цены деления прибора концентрацию калибровочного раствора делят на показание прибора и подсчитывают среднее значение из трех концентраций, К: АТФ = 0,37; АДФ = 0,50: АМФ = 0,27. При расчете концентрации адекилата в исследуемом образце (экстракте) показания микроденситометра умножают на соответствующий коэффициент и кратность разведения (в данном случае 6).П р и м е р 2. Печень крыс тщательноперфузируют 0,9-ным йаС, осушаютфильтровальной бумагой, навеску 10 мг гомогенизируют в 500 мкл 0,4 ИНС 04. Дляопределения точности метода к полученнымэкстрактам добавляют стандартные растворы аденилатов в конечной концентрации20 рМ (внутренний стандарт). Хроматографирование и измерение количества аденилатов проводят описанным в примере 1способом,Результаты определения точности ивоспроизводимости метода представлены втабл.З.Образцы с 1 по 4 - параллельно сделанные вытяжки из печени одной крысы.Результаты измерений на примереэкстрактов из печени крыс свидетельствуют о том, что воспроизводимость способасоставляет 93 - 85, а его точность - 97 -98 оПриводятся примеры обоснования режимов осуществления способа; концентрации добавляемого дансилхлорида (табл.4),рН инкубационной среды (табл,5), температуры и времени инкубации (табл.б), а такжерезультаты определения чувствительностиспособа. Последовательным разведениемстандартных растворов нуклеотидов (АТФ,АДФ, АМФ) находят ту предельную концентрацию нуклеотидов, при дальнейшем снижении которой определение даннымспособом становится невозможным. Установленной таким образом концентрациейопределяют чувствительность способа,На основании результатов исследовакия оптимальной концентрацией дансилхлорида следует считать 0,50 ь, превышениекоторой не приводило к дальнейшему повы- .шению выхода флоуресценции.На основании результатов исследования оптимальными значениями рН для проведения реакции дансилирования следуетсчитать рН 10 - 12,На основании результатов, приведенных в табл,6, обосновывается оптимальныйрежим температуры инкубации при проведении реакции дансилирования (30 - 400) исоответствующее время инкубации до окончания реакции (полное обесцвечивание раствора),Результаты определения чувствительности предлагаемого способа. Чувствительность метода, моль нуклеотида в пятне: О 5 х 10; 0 75 х 10; 0,85 х х 10; 1 0 х 10; 05 х 101709218 Таблица 1Определение стандартных растворов нуклеотидов Таблица 2 Определение концентрации нуклеотндое в экстрактах крови н АМФ: 1 - кровь свиньи, со 2- кровь свиньи, со 3 - кровь адороеото 4 - кровь больното рмвщевсл несбалансированном питательном рационе:ривще Вел нв рационе сннкен нов на бо р калорийности; Тблицэз ф вец, тв риклеточн М нмольlмтнцентрацнл екот акте М нттрнкл етонние л л, нмоль/ли лонцентрэцнл еакст кте Стан арт ан Вн 029 ОЗ 0,32 2,9 3,1 зл гз.о 233 226 22.9 013 10,0 11.0 10,6 1 О.а 10,4 0 4 8,1 8,7 8.4 2,86 3,00 з,оо 2,9 0,037 9,0 9.3 9,8 9,4.4 16 1 7 Средняя арифметическая; 0,72 х 10, Средняя ошибка средней арифметической 0,1 х 10 ф.Средняя чувствительность способа составляет 0,72 х 10 моль нуклеотида в пят не.Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения адениловых нуклеотидов в 1000 раз по сравнению с прототипом, информативность за счет од новременного определения АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе, эко 74 омичность за счет применения более дешевых и менее дефицитных реактивов и приборов. 15Формула изобретенияСпособ определения адениловых нуклеотидов в биологическом материале путем приготовления экстракта с последующим хроматографическим разделением, о т л и-, ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, информативности эа счет одновременного определения АТФ, АДФ, АМФ в одной пробе, дополнительно проводят реакцию дансилирования пробы с 0,5-ным ацетоновым раствором 5-диметиламинонафталин-сульфонилхло - рида при соотношении воды и ацетона в реакционной смеси 1,1, рН 10 - 12 и инкубации в темноте при 30 - 40 С, а хроматографическое разделение проводят в тонком слое силикагеля при использовании хроматографической смеси 1,4-диоксан-иэопропанол-аммик-вода в соотношении 40:10.8:22 с последующим флуориметрическим определением количества адениловых нуклеотидов после облучения хроматограммы ультрафиолетовым светом,1709218 Таблица 4 Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов (0,25 мМ) от концентрации добавляемого дансилхлоридаТаблица 5 Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов (О,1 мМ) от рН инкубационной смесиТаблица 6 Зависимость интенсивности флуоресценции пятен стандартных растворов нуклеотидов (0,1 мМ) и времени инкубации от температуры инкубационной смеси Составитель Н. ТеренТехред М.Моргентал ректор Т, Палий ктор Ю. Се Заказ 421 Тираж Подписное ВНИИПИ Гссударственного комитета-по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж-З 5, Раушская наб., 4/5 одственно-издательский комбинат "Патент", г, ужгород, ул.Гагарина П