Способ получения ферментного препарата, обладающего уреазной активностью

Соез СоветсникСоциапистичесникРеспублик ТОРСКО ЕТЕЛЬСТ 8 У(22)Заявлено 12.05.80 (21) 2923885/28-13с присоединением заявки М(23) ПриоритетК 35178 Гоаударетасны% квинтет СССРлаи эебретеннйн вткрытнй публиковано 28 2.82, Бал нь М 53) УДК 615. 45: :615 7 577 .155 33(088.8 описания 28.0282 а опубликова.И.Кургана г ихтя орыетени миоьковскии научно-исследовательски) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ фЕРМЕНТНОГО ПРЕПАР ОБЛАДАЮЩЕГО УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 1 эоб гическ олог е обеспе- препара 15 остьюСамнеющи пальцах сезагружают руют 7 л О, ного буфера нных на "Огонек кстраги фосфат товленн содержинтетра е сый акНел рьевой тивносПос го на дистил щей 10 Матриевой соя тем,ного о в с епара тение относится к фармацевпромышленности и касается и получения ферментных пре паратов.Известен способ полученияного препарата, обладающегоактивностью, путем измельченарбуза сорта "Любимец хутораский", экстрагирования сырьяпри рН 6,9-7,2 и 18-25 С и ополученного экстракта ацетонследующим выделением целевогоОднако известный способ нчивает получение ферментногота с высокой уреазной активн(на 1 г препарата 350-450 ед фермент" реазной я семян Пятигорводой чист ки м с по 1 В ьпродукизобретения - расширен азы и повышение уреазн целевого продукта. вленная цель достигает особе получения фермен а, обладающего уреазно тивностью, включающем измельчениесемян арбуза, их экстрагированиепри рН 6 9-70 и температуре 18-25 Сочистку гюлученного экстракта и выделение целевого продукта, в качествеисходного сырья используют измельченные семена арбуза сорта "Огонек" вида ССга 11 цэ Чи 1 цагеэ 5 о 1 тгадэкстрагирование проводят фосфатным буферомпри соотношении сырье-экстрагент1:3- 1".4 и очистку полученного экстракта осуществляют насыщенным раствором аммония сульфата, а затем этанол этанол-раствор ом при соотношении: 1, 5-1: 2,5.Сгюсоб осуществлябраэом.2 кг измельчеян арбуза сортэкстрактор и эалий-натриевогоН 6,8-7,0 пригоированной воде,ДТА (этилендиам3 908359 ли уксусной кислоты) и 10И Ь -меркаптоэтанола в течение 1 ч 50 мин при 22-24 ОС. После освобождения экстракта от муки центрифугированием при 4 С с частотой вращения ротора 3000 об/мин (2600 ц) в полученных 5,8 л экстракта проводят первичное осаждение белков насыщенным раствором аммония, сульфата, добавляя последнего 3,87 л. После отстаивания 1 о в течение 6 ч образующийся осадокв отделяют центрифугированием при 4 С с частотой вращения ротора 3000 об/мин (2600 ц), а к надорадочной жидкости вновь добавляют 1,93 л 15 насыщенного раствора аммония сульфата. Оставляют для отстаивания в течение 10 ч. Затем осадок белка, содержащий активный фермент, растворяют в 200 мл воды, охлаждают до +10 С и осаждают этиловым спиртомов соотношении раствор-этиловый спирт 1:2. Оставляют для образования осадка на 2 ч. Затем осадок отделяют центрифугированием при 4 С с частотой вращения ротора 3000 об/мин в течение 10 мин. Насадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают при -40 С в течение 2 ч и высушивают суб- зоолимацией в глубоком вакууме с темпеоратурой на противне +30 С в течение 8 ч. Уреазная активность полученного продукта составляет 1500 ед, Самнера на 1 л препарата или 120 мкмоль мочевины в 1 мин на 1 мг белка.Полученный ферментный препарат представляет собой белый аморфный порошок, растворимый в воде, фосфатном буферном растворе рН 7,0-7,4. Продолжение табл,1 Соотношение сыУрезная активностьв единицах амнера//1 г белка рья и экстрагента 283, 3 211,9 84, 7 1:3,0 1:2,5 В табл.2 представлена зависимостьуреазной активности от степени насыщения экстракта сернокислым аммонием,20 Таблица 2 Уреазная активностьв ед. Самнера на1 г белка 20 26000 35 50000 42,5 90000 45 120000 110000 100000 47 5 50 60000 60 40000 Таблица 1 Уреазная активностьв единицах самнера//1 г белка Соотношение сырья и экстрагентаи Уреазная активность в ед на 1 г белка самнераСоотношение этанол - раствор 165 1:5,0 1:4,5 1:4,0 190, 1 250 5 96200 190500 1:1,5 В табл.1 представлена зависимостьуреазной активности от соотношениясырья и экстрагента. В табл. 3 представлена зависимость уреазной активности от соотношения этанола и раствора целевого продукта,Таблица 35 90 Е 359Продолжение табл.3 аформула изобретения Соотношение этанол - раствор Урезная активностьв ед на 1 г белкаамнера 1:2,01,2 6 о 1:3,0 213000 200600 170400 25 Составитель В, Брусиловская Редактор И.Тыкей Техред Н,Бабинец Корректор Г.НазароваЗаказ 678/6 Тираж 717 ПодписноеВН 11 ИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035., Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5 Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная,Исследование острой токсичностивыделенного целевого продукта при попадании внутрь (на животных) в концентрации 10 г на 1 кг веса показали, что уреазэ не вызывает отравления. При попадании на кожу и слизистые оболочки не вызывает раздражения,Предлагаемый способ позволяет поюлучить ферментный препарат, обладающий в 4 раза большей уреазной активностью,Способ получения ферментного препарата, обладающего уреазной активностью, путем измельчения семян арбуза, их экстрагирования при рН 6,97,0 и температуре 18-25 ф С, очисткиполученного экстракта и выделенияцелевого продукта, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью расширения сырьевой базы и повышения активности целевого продукта, в качестве исходного сырья используют измельченные семена арбуза сорта "Огонек"вида С 1 йгц 11 цв Уц 1 цаг 1 з 5 сИгад, экстрагирование проводят фосфатным буфером при соотношении сырье-экстрагент 1:3- 1:4 и очистку полученногоэкстракта осуществляют насыщеннымраствором аммония сульфата, а затемэтанолом при соотношении этанол-раствор 1:1,5-1:2,5.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР11 595335, кл. В 6 1 К 35/78,28.02.78,1