Способ видовой идентификации л-форм микобактерий

(51)5 С 12 й 1 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ВИДЕТЕЛ ЬСТВУ К АВТОРСКО ОВОЙ ИДЕНТИФИКАКОБАКТЕ РИЙтносится к ветеринарной астности к прямому опи принадлежности (иденмикобактерий, и может для диагностики Л-форм ркулеза крупного рогато- типичных Л-форм мико(54) СПОСОБ ВИД ЦИИ Л-ФОРМ МИ (57) Изобретение о микробиологии, в ределению видово тификации) Л-форм быть использовано микобактерий тубе го скота, а также а форм рий ГОСУДАРСТВЕ.НЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(56) Дорожкова И,Р. и совет, ВыделениеЛ-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала. Методические рекомендации. М., МЗ СССР, 1984. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к прямому определению видовой принадлежности (идентификации) Л-форм микобактерий, и может быть использовано для диагностики Л-форм микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота, а также атипичных Л-форм микобрактерий.Известен способ определения видовой принадлежности Л-форм микобактерий, заключающийся в следующем. Из патологического материала животного или человека после предварительной обработки материала серной киготой проводят культуральный посев на полужидкую питательную бактерий. Цель изобретения - ускорение способа, Для этого гомогенат исследуемого материала высевают на питательную среду, содержащую, мас.: Л-аспарагин 0,41- 0,56; лимоннокислый натрий 0,35 - 0,475; сернокислый магний 0,05 - 0,07; лимонно- кислое аммиачное железо 0,005 - 0,007; фосфорнокислый одноэамещенный калий 0,026 - 0,035; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,25-0,335; глицерин 7,44- 10,28; бромтимоловый синий в 1 мл 0,1 н, раствора едкого натрия рН 7,2-7,6 0,003- 0,005, сыворотка крови крупного рогатого скота 10; дистиллированная вода остальное, После инкубирования отделяют биомассу Л- форм центрифугированием, промывают физиологическим раствором в течение 10 - 15 мин, центрифугируют при 2,5-3,0 тыс. об/мин, С выделенной,ДНК Л-форм проводят, реакцию перекрестной ДН К-ДНК гибридизации и по гомологичности ДНК Л- определенному виду ДНК микобакте идентифицируют Л-формы. среду (модификация основы полужидкой -казеиновой среды Школьникавой), которая (содержит,г/л: фосфорнокислый однозамещенный калий 1,5; фосфорнокислый двуза- Ц 1мещенный натрий 2,5; сернокислый магний0,5; лимоннокислый натрий 1,5; лимонно- скислое аммиачное железо 0,05; аспарагин юф1,0; глицерин 30 мл; агар-агар 3,0; дистилли- дрованная вода остальное, и добавки к 1 лсреды: сахароза 286,0; сыворотка кровикрупного рогатого скота 143 мл; стрептоми-,цин 1 - 5 тыс.ед пенициллин 1-5 тыс. едраствор Люголя 5 мл,На указанной полужидкой среде культивируют посевной материал при 37"С в тече 168 76055 10 ние 1-1,5 мес и после предварительного тестирования Л-форм микобактерий методом фаэово-контрастной микроскопии проводят реверсию полученной культуры Л-форм микобактерий методом культурального пассажа (3-5 и более, каждый последующий пассаж проводят на свеже- приготовленную питательную среду, длительность одного пассажа 1-1,5 мес), параллельно проводят пассажи также на морских свинках (3 - 5 и более, на каждый пассаж используют трех животных, длительность одного пассажа 3 мес), Получают в среднем через 9-12 мес из исходной культуры микобактерий в Л-фарме их ревертанты в бактериальной форме, определяют видовую принадлежность ревертантов с помощью применения общепринятых культуральных, тинкториальных и биохимических методов исследования, после чего проводят учет результата - определение видовой принадлежности изучаемых Л-форм микобактерий по полученной видовой принадлежности их бактериальных ревертантов.Однако реализация известного способа требует затраты длительного времени от начала способа до получения результата,Цель изобретения - ускорение способа,П р и м е р 1. Обрабатывают патологоанатомический материал от подопытного теленка, производят посев гомогенизированного материала (смешанного с физиологическим раствором в соотношении 1/3) по 0,2 мл в приготовленные емкости с 50 мл предлагаемой питательной среды следующего состава, мас. , Л-аспарагин 0,41; лимоннокислый натрий 0,35; сернокислый магний 0,05; лимоннокислое аммиачное железо 0,005; фосфорнокислый однозамещенный калий 0,026; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,25; глицерин 7,44; бромтимоловый синий 0,003 в 1 мл 0,1 н. стандартного раствора едкого натрия (рН 7,6); сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное, Культивируют посевной материал при 37 С в течение 1 мес, проводят тестирование Л-форм микобактерий в нативных мазках методом фаэово-контрастной микроскопии, которое показывает на ичие Л-культуры микобактерий и ее чистоту (отсутствие бактериальных форм микобактерий показали также общепринятые контроли). Далее изолируют Л-культуру микобактерий из жидкой среды центрифугированием при 2,5 тыс. об/мин в течение 10 мин, биомассу Л-форм трехкратно отмывают физиологическим раствором в соотноше 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нии 1/50, центрифугируя при 2.5 тыс, об/мин по 10 мин. Иэ полученного осадка культуральной биомассы (0,45 г) выделяют ДНК Л-форм микобактерий, после чего проводят реакцию перекрестной ДНК-ДНК гибридизации. Конечный результат реакции перекрестной ДНК-ДНК гибридизации показывает, что ДНК исследуемых Л-форм микобактерий гомологична ДНК М, Ьочз. Таким образом, изучаемая Л-культура принадлежит к виду М, Ьочз. П р и м е р 2, Аналогично примеру 1 обрабатывают патолого-анатомический материал от другого подопытного теленка, проводят соответственный посев на предлагаемую среду следующего состава, мас,: Л-аспарагин 0,48; лимоннокислый натрий 0,408; сернокислый магний 0,06; лимонно- кислое аммиачное железо 0,006; фосфорно- кислый одноэамещенный калий 0,03; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,288; глицерин 8,64; бромтимоловый синий 0,004 в 1 мл 0,1 н, стандартного раствора едкого натрия (рН 7,4); сыворотка крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное. Культивируют посевной материал в течение 1,2 мес, после тестирования центрифугируют с отмыванием осадка Л- культуры при 2,7 тыс, об/мин по 12 мин. Получают 0,7 г нативной биомассы Л-форм микобактерий, Далее, выделив ДНК Л-форм микобактерий, проводят реакцию ДН К-ДН К перекрестной гибридизации, которая показывает, что ДНК исследуемой Л-культуры гомологична ДНК М, Ьочз, и учет результата. Изучаемая культура Л-форм микобактерий является Л-формой М.Ьоч 1 з. П р и м е р 3. Аналогично приведенным примерам проводят посев патолого-анатомического материала от третьего теленка (из соответствующего опыта) на предлагаемую среду следующего состава, мас.ф; Л-аспарагин 0,56; лимоннокислый натрий 0,475; сернокислый магний 0,07; лимонно- кислое аммиачное железо 0,007; фосфорно- кислый однозамещенный калий 0,035; фосфорнокислый двузамещенный натрий 0,335; глицерин 10,28, бромтимоловый синий 0,005 в 1 мл 0,1 н. стандартного раствора едкого натрия (рН 7,2); сыворотка крови крупного рогатого скота 10,0; дистиллированная вода остальное. Культивируют посевной материал в течение 1,5 мес, тестируют, центрифугируют при 3,0 тыс, об/мин по 15 мин, Получают 0,5 г нативной биомассы Л-форм микобактерий. Далее, выделив из нативной биомассы культуры ДНК Л-форм микобактерий, проводят реакцию1687605 перекрестной ДНК-ДНК гибридизации и учет результата. Изучаемая культура Л- форм является Л-формой М,Ьочз,Предлагаемый способ позволяет ускорить идентификацию Л-форм,Формула изобретения Составитель Г. СмирноваТехред М.Моргентал Корректор В. Гирняк Редактор М. Петрова Заказ 3678 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Способ видовой идентификации Л-форм микобактерий путем взятия материала от животных, обработки его серной кислотой, посева на питательную среду, содержащую Л-аспарагин, лимоннокислый натрий, серно- кислый магний, лимоннокислое аммиачное железо, фосфорнокислый однозамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, глицерин, индикатор, сыворотку крови крупного рогатого скота и дистиллированную воду, инкубирования посевов с последу. ющим тестированием и учетом результатов, отличающийся тем,что,с целью ускорения способа, питательная среда в качестве индикатора содержит раствор бромтимолового синего в 1 мл 0,1 н. раствора едкого натрия рН 7,2 - 7,6 при следующем количественном соотношении компонентов, мас,: Л-аспарагин 0,41-0,56Лимоннокислый натрий 0,35 - 0,475Сернокислый магний 0,05 - 0,07Лимоннокислое амми 5 ачное железо 0,005 - 0,007Фосфорнокислый однозамещенный калий 0,026 - 0,035Фосфорнокислый двуэамещенный натрий 0,25-0,335 10 Глицерин 7,44-10,28Бромтимоловый синийв 1 мл 0,1 н, раствораедкого натриярН 7,2 - 7,6 0,003 - 0,005 15 Сыворотка крови крупного рогатого скота 10Дистиллированнаявода Остальноепосле инкубирования отделяют биомассу 20 Л-форм центрифугированием, промываютфизиологическим раствором в течение 1 О 15 мин центрифугированием при 2,5-3,0тыс. об/мин, а тестирование и учет результатов осуществляют с помощью реакции пе рекрестной ДНК-ДНК гибридизации погомологичности ДНК Л-форм микобактерийопределенному виду ДНК микобактерий.