Способ получения штаммов возбудителя чумы с hfr свойствами

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧГСКИХРЕСПУБЛИК 1)5 С 12 й 15 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР фффЭЮЗИРЯффффф. ТЕЩР,Г;,:;.,ВЛИОТГ- -,",Е ИЗСБРЕТЕНИ"Микроб"липпов и О,А ро(56) ЗоЬпзоп З.й. й Тгапзрозоп 1 ас 1 теб гесс.пи сЬо 1 егае, - Мо Оеп, Оепет, 1 р. 93-101. е 19 Я.К;атоп 1 п Ч 1 ЬГ 1 о 9, ч. 170,%1,Кутырев В.В., Проценко П.И. Создание штамма чум бладающего свойствами эффе а. - Мол, генетика, 1 С 184, М нисимов икроба, го доноО,А ного- 7. Изобретение относится к микробиологии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использовано для получения Нг-доноров возбудителя,Целью изобретения является повышение частоты образования Нг-штаммов,Способ заключается в том, что в бактериальные клетки вводят гетерологичную коньюгативную плазмиду Р 1 ас.,Тп, трансконьюганты рассевают до изолированных клонов и отбирают клоны, имеющие Н 1 г-доноров, однако при этом в качестве реципиентов Р ас,",Тп используют штаммы возбудителя чумы, несущие плазмиду кальцийэависимости (рСаб), в качестве селективной среды для отбора Н 1 г-доноров -щаяства оста несу- иевопо нной ы не- дами(71) Всесоюзный научнопротивочумный институ(57) Изобретение относится к микробиоло гии, в частности к генетике возбудителя чумы, и может быть использовано для получения Н 1 г-доноров возбудителя. Целью изобретения является повышение частоты образования Н 1 г-штаммов. Способ заключается в том, что плазмиду Г 1 асффТп вводят в бактериальные клетки, содержащие плазмиду кальцийзависимости (рСаб). Трансконьюганты выращивают на магниево-аксалатном агаре, приготовленном на основе среды Энда, Отбор кланов с Н 5 г-.свойствами осуществляют по сочетанию признаков кальцийзависимости и спо- З собности сбраживать лактозу и последующей проверкой на перекос хромосомных маркеров в спот-тесте. Эффективность способа 100, в расчете на а выделенные Саб+1.ас+-клоны. магниево-оксалатный агар на основе средыЭндо и отбирают клоны с сочетанием признака кальцийзависимости (Саб+) и способности сбраживать лактоэу ( ас ). Плазмида рСаб 1.резт 1 з, играю большую функцию в обеспечении сво вирулентности, детерминирует, наоя другими признаками, зависимость р клеток от ионов Са 2+ при 37 С, Клоны,щие рСаб, не способны расти на магн оксалатном ага ре, дефектном содержанию ионов, кальция, при указа. температуре, но вырастают при 28 С,Плаэмида рСаб возбудителя чум совместима с коньюгативными плазми+передаче последней штамму рСаб наблюдается выраженная элиминация как резидентной,так и в особенности, введенной плазмиды (при,раэдельном нахождении в 5 клетках возбудителя оба репликона сохраняются достаточно стабильно). О наличии Е 1 асТп в клонах судят по устойчивости к хлорамфениколу(в случае Тп 9) или канамицу Тп 5), а также по способности сбраживать 10 лактозу и, соответственно, по формированию окрашенных колоний на среде Эндо (природные штаммы 1.рез 1 з лактозонегативны),Предлагаемая комбинированная магни ево-оксалатная среда на основе агара Эндо позволяет одновременно тестировать микробную популяцию по признакам, кодируемым обеими плазмидами. При высеве на нее трансконьюгантов рСас Е 1 ас:;Тп боль шинство субклонов (69-910, в среднем 770) кальцийэависимы, не спосооны сбраживать лактозу и несут, по данным последующего скрининг-электрофореза, лишь резидентную плазмиду. Другая эначитель ная фетотипическая группа(9 - 30, в среднем 170 ь) - Сасас - обнаруживает лишь фракцию плазмидной ДНК, соответствующую по молекулярной массе Рас;Тп.Кроме того, в каждом опыте выявляется 30 относительно небольшое количество (1 - 120 в среднем 50) субклонов, сохранивших как кальцийзависимость, так и лактозопозитивность (Садас+). Однакоэлектрофоретический анализ показывает наличие у них только одной автономной плазмиды - рСаг 1 что свидетельствует о вероятной интеграции Е 1 ас.:Тп с бактериальной хромосомой. Изучение донорной активности позволяет получить генетические доказательства интеграции: практически все тестируемые субклоны обладают свойствами Нтг-доноров. Они осуществляют градиентный перенос хромосомных генов, в ряде случаев - с высокой частотой (до и 10 з) и не передают маркеры Е 1 ас,Тп ( ас - признак и устойчивость к соответствующему антибиотику).Показано, что транспоэоны Тп 9 и Тп 5 транслоцируатся из плазмиды Еас в хромосому возбудителя чумы с чрезвычайно высокой частотой - до 100% в расчете на клетку, потерявшую вектор. Таким образом, при передаче Е 1 ас;,Тп возбудителю происходит спонтанное формирование транспозонных областей гомологии (на конъюгативной плазмиде и в хромосоме), Далее имеет место гомологичная рекомбинация, приводящая к внедрению Е 1 ас;Тп в бактериальную хромосому и образованию НЬ-доноров. Этот процесс, по видимому также идет с высокой эффективностью, поскольку, по данным изучения популяционного состава трансконъюгантов рСад Е 1 асТп, доля клонов с интегрированной коньюгативной плазмидой составляет 1 - 12 оПри совместном нахождении в клетках возбудителя чумы Е 1 асТп обычно сохраняется менее стойко, чем р,Сад. Интеграция с хромосомой, вероятно, приводит к повышению стабильности наследования Е 1 асТп, что внешне проявляется в возникновении клонов Сас ас+, Использование комбинированной селективной среды позволяет по сочетанию этих двух фенотипичных признаков целенаправленно, с высокой эффективностью отбирать клоны, несущие вставку конъюгативной плазмиды в хромосому, а следовательно, искомые НГг-доноры,П р и м е р. Плазмиду Е 1 ас:;Тп 9 (Е 1 асТп) передают в межродовых коньюгационных скрещиваниях от Езсйег 1 сЫа со 1 АВ 51-11 гесА штамму возбудителя чумы, несущему плазмиду кальцийзависимости (например, 1 резтз 358/12).Для этого 3-часовую культуру донора, выращенную в бульоне Хоттингера (рН,2 на качалке до концентрации около 10 м.к,мл, смешивают с ночной бульонной культурой реципиента в соотношении 1:2 и инкубируют при 28 С в течение 3 ч. Коньюгационную смесь высевают на пластинки агара Хоттингера (рН 7,2) с добавлением полимиксина в концентрации 100 ед/мл (контрселективный агент;возбудителю чумы свойственна природная устойчивость к полимиксину), а также антибиотика в соответствии с маркером транспозона - 25 мкгlмл хлорам феникола (в случае Тп 9) или канамицина (при использовании Тп 5).Выросшие через трое суток трансконьюганты (отбирают 4 - 5 клонов) после однократного пассажа на селективной среде пересевают петлей на агар Эндо, изучают с помощью скрининг-электрофореза плазмидной ДНК и одновременно высевают на комбинированную магниево-оксалатную среду на основе агара Эндо.Для ее приготовления к 150 мл горячей среды Эндо (1 50-550 С) добавляют 14 мл 0,25 М Ьксалата натрия, смесь взбалтывают и через 2 - 4 мин вносят 7 мл 0,5 М сульфата или хлорида магния. После перемешивания среда готова к разливу.Растворы солей стерилизуют автоклавированием при 1100 С(0,5 атм) в течение 30 мин.Каждый клон высевают на 2-3 чашки так, чтобы получить 200-300 изолированных колоний на агарной пластине. Посевы инкуЗаказ 3383 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, К, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент",г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 бируют двое суток при 37 С, после чего отмечают выросшие колонии кальцийиезависимых субклонов и переносят чашки в термостат при 28 С. Через сутки отмечают доросшие - кальцийзависимые колонии. Из них отбирают лактозспозитивиые варианты (около 50 субклонов), отсевают иа агар Хоттингера, проверяют на наличие маркера транспоэона, изучают с помощью электрофореза клеточных лизатов и используют в качестве доноров хромоссмных генов в спотскрещиваниях сс стрептсмицино- устойчивыми ауксотрофными мутаитами возбудителя чумы.Использование нескольких независимых нитроэогуанидин- или траиспозоииидуцированных реципиентов с повреждением одного - двух маркеров позволяет идентифицировать Н 1 г-штаммы с различными 0-пунктами переноса,Ночные бульонные культуры реципиеитных штаммов с помощью металлических рапликаторов наносят на поверхность подсушенных чашек с селективной средой (минимальный агар с добавлением стрептомицииа в концентрации 100 мкг/мл и.факторов роста в соответствии с природой ауксотрофностью реципиента, исключая питательные вещества, требуемые в результате мутации).Концентрация аминокислот (в а-форме) и азотистых оснований в среде составляет 10 мкг/мл, тиамина и никотиновой кислоты 1 мкг/мл.После впитывания в агар на пятна культуры реципиента с помощью таких же репликаторов наносят ночные бульонные культуры предполагаемых Н 1 г-доноров, Через 3-6 сут отмечают рост рекомбииантов.Доноры, дающие наибольшее количество колоний рекомбинантов в спот-тестах, излечивают от плазмиды рСаб, наличие которой может неблагоприятно сказываться на стабильности Н 1 г-штамма. С этой целью 5 10 15 О Ф 5 30 35 40 кул.туры высеваю. иа магниевс-сксалатиый агар, отбирают по три кальцийнезависимых субклсиа и тестируют их с помощью скрииинг-электрофореэа. По сдисму производному, потерявшему рСас, отбирают для дальнейшего изучения в развернутых скрешиваииях с полиауксотрофиыми нитраэсгуаиидиииидуцирсваниыми мутантами возбудителя чумы.Преимущество предлагаемого способа заключается режде всего в чрезвычайно высокой эффективности (100 в расчете иа изолированный Саоас -клон по сравнению с 10 Х-ной эффективностью известного способа. Гпсссб весьма надежен и позволяет в короткие орски (примернс в течение трех недель от момента посева Л,резсэ рСао для скрещивания с Е.ссИ ГасТп и до учета результатов спот-скрещиваний) целенаправленно получать десятки Нй-доноров с различными сайтами интеграции плазмиды Г ас;:Тп, в тс время как получение Нгдоноров с помощью известного способа не всегдаеоспроизвсдимо ввиду весьма слабсгс роста возбудителя при 40 СС. Способ менее трудоемок, так как в ием отсуствует стадия выращивания возбудителя в бульоне в течение 18 ч.Формула изобретения Способ получения штаммов возбудителя чумы с Н 1 г-свойствами, включающий введение в бактериальиые клетки плазмиды Е 1 асТп, выращивание клеток на средах, содержащих антибиотик, детерминируемый траиспозонсм плаэмиды, отбор Н 1 г-штаммов, сохраняющих плазмидные маркеры, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения частоты образования Нгштаммсв, в качестве реципиентов плаэмиды Р 1 асТп используют штаммы возбудителя чумы, содержащие плазмиду кальцийзависимости, а.отбирают Н 1 г-штаммы, сочетающие признаки кальцийзависимости и способность сбраживать лактоэу.