Штамм бактерий рsеudомоnаs sp., разлагающий метилацетат

(51)5 С 12 й 1/ 2 33/О РЕТЕНИ кр ина,.А,Тро кие синрган 3.Методы эксп мии. - М.; Хи ри Я,авеаЪ ы- А, ая ред- лен ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Институт биохимии и физиологиироорганизмов АН СССР и Институт мбйологии и вирусологии АН КазССР(72) Д.Ю.Раков, Н;В,Доро ко и Р,М,Алиева (53) 663,15(088.8) (56) Бюлер НПирсон Д, тезы, ч. 2, - М.: Мир, 197Вейганд-Хильгетач, мента в органической х 1968,54) ШТАММ БАКТЕРИЙ РЗЕОООМО 5 Р РАЗЛАГАЮЩИЙ МЕТИЛАЦЕТАТ Изобретение относится к области биотехнологии и. касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства.Цель изобретения - получение нового штамма микроорганизма, обладающего способностью разлагать метилацетат.Метилацетат(метиловый эфир уксусной кислоты) - летучий, высокотоксичный синтетический поллютант, химически устойчивый при нормальных условиях. В литературе нет сведений о микробной деградации этого соединения,Изобретение заключается в том; что в делен штамм Рзеобовопаз зр. 24 й разлагающий метилацетат. Предельн концентрация метилацетата, при которой наблюдается его полное разложение и лагаемым штаммом, 1 г/л. Штамм выде(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства. Целью изобретения является получение нового штамма микроор.ганизма, обладающего способностью разлагать метилацетат. Штамм Рзеобоаопаз зр, ВКМ ВД выделен иэ сточных вод аце тальдегидного производства в Казахской ССР. Штамм обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 1 г/л, используя продукты его гидролиза - метанол и ацетат в качестве источников углерода и энергии, После предварительной адаптации культуры она полностью разлагает метилацетат за 30 ч.1 табл. иэ сточных вод ацетальдегидного производства.Штамм обладает карбоксилзстеразой и разлагает метилацетат, используя продукты его гидролиза - ацетат и при низких концентрациях (до 0,1 г/л) метанол в качестве источников углерода и энергии.Культурально-морфологические признаки, Клетки - бесцветные, подвижные палочки 0,5 - 0,71,3 - 1,7 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорообразующие, не имеющие сложных внутрицитоплазматических мембран, подобных метанотрофным бактериям. Не имеет простек, Размножается делением пополам. Колонии на МПА до 5 мм в диаметре, округлые, непрозрачные, с ровным краем, белые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция тесто- - образная.(пример 1) с метилацетатом, глюкозо-картофельный агар,Физиолого-биохимические признаки.Азроб, растет при 10-39 С, оптимум 2832 С. Оптимум рН 6,8-7,2, при рН 3,6 нерастет, Флоуресцирующие пигменты, пиоционин, каротиноиды не образует. Имеетоксидазу, каталазу, аргининдигидролазу.Нитраты восстанавливает в нитриты, Леваниз сахарозы, ацетоин, индол, ацетилме, тилкарбонол не образует. Желатин, целлюлозу, поли-ф-оксибутират не разлагает,но гидролизует крахмал и твин. Поли 3 -оксибутират внутриклеточно не накапливается. 01: ф-оксибутират не использует в качестве источника углерода внедостаточной по азоту среде.. Источниками углерода для роста служат; формиат, метанол или этанол при низких концентрациях(до 0,1 г/л), метилацетат,этилацетат, этилформиат, бутилацетат, изопропанол, изобутанол, 1:арабиноза, фруктоза. -рамноза, О-рибоза, Р-ксилоэа,глюкоза, сахароза, О-серин, ацетат, бетаин, саркозин, глицин, фумарат. сукцинат,й -кето глута рат.Среду с глюкозой подкисляют, газообразование отсутствует, Анаэробно не ферментирует глюкозу. Рост не обеспечиваютформальдегид, метиламин, деметиламин,триметиламин, этиламин, трегалоза, 3аланин,-серин, фенилаланин, 01:аргинин.глиоксилат, и-оксибензоат. м-оксибензоат,мезоинозит.Не растет автотрофно в атмосфереСО 2+ Н 2+ 02. В качестве источников азотаиспользует соли аммония, нитраты, некоторые аминокислоты. В ростовых факторах ненуждается.Штамм обладает индуцибельной карбоксилэстеразой, катилизирующей гидролизэфирной связи метилацетата с образованиемметанола и ацетата, Ацетат ассимилируетсячерез цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт(изоцитратлиазу и малатсинтаэу). Метанол ассимилируется черезсериновый путь С 1-метаболизма, Штамм неимеет метанолдегидрогенаэы (ФМС,НАО), но обладает алкогольоксидазой, дегидрогеназами формальдегида (НАЦ, ОЗН)и формиата (ФМС), оксипируватредуктазой, серинглиоксилатаминотрансферазой,малатлиазой, фосфоенолпируваткарбоксилазой,Ключевые ферменты рибулозомонофосфатного пути фиксации формальдегида(гексулозофосфатсинтеза) и цикла Кальвина Жавтотрофной фиксации углекислоты (рибулозобисфосфаткарбоксилаза) отсутствуют.Штамм является факультативным мети 5 лотрофом.Условия хранения штамма.Шамм хранится в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда - молоко,при этом свойства штамма устойчивы. В ла 10 бораторных условиях культура поддерживается на косяках с МПА и пересевается через2 нед.Поскольку карбоксилэстераза, осуществляющая. гидролиз эфирной связи метила 15 цетата, индуцибельна, существенныеотличия наблюдаются при использованииэтого субстрата адаптированной и не адаптированной культурой, Адаптированнаякультура Рзеибогпопаз зр, ВКМ ВД20 осуществляет разложение метилацетатапри его концентрациях 0,1 - 2,0 г/л за9-30 ч соответственно (таблица).В стоках ацетальдегидного производства содержится около 0,15-0,29 г/л метила 25 цетата, однако при залповых выбросахконцентрация этого соединения может до;стигать 1,0 г/л,П р и м е р 1. Использование метилацетата неадаптированной культурой.ЗС Культуру Рзецбоаопаз зр. 24 ВА выращивают на МЙА в течение суток, Суспензиювыросшей культуры (неадаптированной)высевают в колбы на 750 мл со 100 млсреды следующего состава, г/л дистилли 35 рованной воды: (ИН 4)2 Н 2 РО 4 1,0; К 2 НРО 41,0; МаС 5,0; М 9304 7 Н 20 2,0; ГеЯО 47 Н 200,004, Среду стерилиэуют при 1 атм 30 мин,метилацетат вносят в колбу в концентрации1 г/л и после засева закрывают резиновой40 пробкой для предотвращения испаренияметилацетата.Культуру выращивают на качалке при180 об,/мин при 29 С. Контроль за процессом деградации метилацетата и анализ45 содержания метанола осуществляют с помощью газовой хроматографии на хроматографе. Колонка (70 см,2 мм) заполненаПорапаком О, Скорость Н 2 30 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, йг 30 мл/мин. Температу 50 ра колонки 110 С.Ацетат определяют на газовом хроматографе, Колонка (1,8 мф= 4 мм) заполненаПорапаком ц. Скорость Н 235 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, И 35 мл/мин, Температу 55 ра колонки 160 С,Процесс разложения метилацетата неадаптированной культурой начинается только через 7 сут. Содержание метилацетата поданным газовой хроматографии через 5 сутсоставляет 97 ф от исходного, через 6 сутаказ 2626 Тираж 362 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина 92 ф , через 7 сут 61 , через 8 сут 10 фи через 9 сут к началу стационарной фазы роста Оф . В среде накапливается 0,1 г/л метанола. Ацетат не обнаруживается,П р и м е р 2. Использование метилаце тата адаптированной культурой.30 мл суспензии, выросшей на среде с метилацетатом двухсуточной культуры Рзецбовопаз эр. 24 ВА ВКМ ВД(адаптированной не менее 3 пассажей на среде с 10 метилацетатом), высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды, описанной в примере 1. В качестве источника углерода и энергии вносят 1 г/л метилацетата. Количественный газохроматографический 15 анализ культуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводят через каждые 3 ч в течение 30 ч культивирования, К 15 ч культивирования20 деградируется 25 метилацетата, к 30 ч культура достигает стационарной фазы роста и метилацетат в среде не обнаруживается. В среде накапливается 0,1 г/л метанола, ацетат отсутствует,Таким образом, штамм Рэецботопаэ эр. ВКМ ВД обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 1 г/л, используя продукции его гидролиза, ацетат и метанол в качестве источников углерода и энергии, что обеспечивает возможность использования данного штамма при биологической очистке промышленных сточных вод ацетальдегидного производства. Формула изобретения Штамм бактерий Рзецбощопаэ зр. ВКМВД,разлагающий метилацетат.