Способ получения изолированных гепатоцитов

(19) 1)5 С 12, й 5/ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ВТО ЕТЕЛЬСТВУ У РОВАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИ НЫХ ГЕПАТОЦИТОВ(57) Изобретение относится к биогии и может быть использовано в кбиологии, экспериментальной иской медицине. Целью изобретенися повышение морфофункциосохранности гепатоцитов, Для этогперфузируют охлажденным до 40ром Коллинза, затем при постоянгенации раствором Хенкса в два эвтором этапе в раствор Хенкса ввоЭДТА. Дезагрегацию осуществляюрозной среде, содержащей 2,5 мстого кальция. 3 табл,кри- родитут го ело- укач кальция при температуре перфузата в момент начала перфузии+37 С и постоянной оксигенации. После этого печень помещают в термостатированный раствор Хенкса и продолжают рециркуляторную перфузию этим же раствором, но с 1 мМ ЭДТА при постоянной оксигенации раствора в течение 30 мин. Скорость перфузии на всех этапах -250 - 300 мл/мин, После окончания перфузии печень освобождают от капсулы, измельчают на холоде (2 - 4 С) ножницами в охлажденной сахарозной среде следующего состава, мМ: сахароза 250; КО 5; Гча 2 НРО 4 0,4; КН 2 РО 4 0,4; М 9 С 2 0,8 мМ; ЭДТА 1; СаС 22,5; НЕРЕЯ 10; альбумин 1, рН 7,5 - 7,4. Дезагрегацию осуществляют с помощью вибрации при частоте 50 Гц в течение 90 с. Полученную суспензию фильтруют через два слоя нейлона, после чего гепатоциты промывают 2-3 раза стандартным раствором Хенкса при центрифугировании 3 - 4 мин 1000 об/мин, Полученный ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт проблем криобиологии иомедицины АН УССР и Московский гской научно-исследовательский инсскорой помощи им, Н.В, Склифосовско, (56) Авторское свидетельство СССРМ 1310426, кл. С 12 й 5/00,1985 (публ,). Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии, экспериментальной и химической медицине.Целью изобние морфо-фунгепатоцитов,П р и м е р 1. Для получения гепатоцитов используют печень, извлеченную из трупов людей, скоропостижно умерших от острой сердечно-сосудистой недостаточности со сроком ишемии не более 1,5-2,0 ч. Вес печени 1500-1700 г, Перфузию печени проводят следующим образом, Нижнюю полую и печеночные вены пересекают между двумя лигатурами, портальную вену канюлируют.На начальном этапе нерециркуляторную перфуэию проводят безкальциевым, охлажденным до+4 С раствором Коллинза, объемом 5,0 л под давлением 100-150 мм вод.ст рН 7,4-7,5, в течение 10 мин. Затем проводят перфуэию 2,0 л раствора Хенкса без ретения является повышекциональной сохранности технололеточной клиничея являетнальной о печень С раствоной окситапа. На дят 1 мМ т в саха- М хлори осадок клеток в соотношении 1:10 заливают средой 199 во флаконы емкостью 250,0 мл и 500,0 мл и хранят в холодильнике при+4 С.В 1,0 мл полученной взвеси содержится в среднем 2 10 клеток.Морфологический контроль суспензии проводят электронно-микроскопически,Электронно-микроскопический анализ изолированных гепатоцитов показывает хорошую сохранность плазматической мембраны, митохондрий наружной мембраны, эндоплазматического ретикулума с рибосомами и т.д.Функциональную активность полученных гепатоцитов определяют по включению . С-гидролизата белков хлореллы.Гепатоциты включают С-гидролизат белков хлореллы более интенсивно, чем по известному способу, что свидетельствует о сохранении белоксинтезирующей системы клеток на более высоком уровне.Результаты белоксинтеэирующей активности гепатоцитов, и 5-б,даны ниже,Одним иэ наиболее чувствительных тестов, позволяющих адекватно судить о сохранности полученных гепатоцитов, является определение мембранного потенциала, которое проводят с помощью потенциал-зависимого флуоресцирующего зонда-катиона ДСМ +/5/. Концентрирование зонда в клетках обусловлено трансмембранным потенциалом цитоплазматической и митохондриальной мембран. Снижение суммарной интенсивности флуоресценции зонда в клетках полученным известным способом свидетельствует о более выраженной деполяризации плаэматической мембраны, увеличении протонной проница Таблица 1 емости клеток. Интенсивность флюоресценции ДМС+ в гепатоцитах, и 5-6, приведена в табл.2Таким образом, заявляемый способ по эволяет получить гепатоциты с более высоким уровнем морфо-функциональной сохранности, чем прототип.П р и м е р 2. Способ осуществляютаналогично примеру 1, но с различными кон центрациями СаС 1 г в среде дезагрегации.Как видно из таблицы, добавка СаС 12 всреду дезагрегации в концентрации 2,5 мМ позволяет получить гепатоциты, включающие 4 С-гидролизат белков хлореллы наибо лее интенсивно. Уровень флуоресценцииДСМ свидетельствует о высоком мембранном потенциале.Функциональные показатели гепатоци-тов, полученных с использованием в среде 20 дезагрегации СаС 12 в различных концентрациях, и 5 - б, даны в табл.ЗТаким образом, из проведенных экспериментов следует, что предлагаемый способ повышает марфо-функциональную сохран ность изолированных гепатоцитов,Формула изобретения Способ получения изолированных гепатоцитов, включающий перфуэию печени раствором Хенкса и последующую дезагре гациювсахароэной среде,отл ича ющийс я тем, что, с целью повышения морфофункциональной сохранности гепатоцитов, перфузию проводят в три этапа: вначале охлажденным раствором Коллинза, далее 35 раствором Хенкса, а затем раствором Хенкса с добавлением 1 мМ ЭДТА при постоянной оксигенации, а дезагрегацию проводят в присутствии хлористого кальция в количестве 2,5 мМ.40Составитель А.МаныкинРедактор Я.Герасимова Техред М.Моргентал Корректор А,ОсауленкоЗаказ 1820 Тираж 381 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101