Способ культивирования вируса висна-мэди

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 475 А 1 5/00, 7/00 5 С САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ СКО ВИДЕТЕЛ ЬСТВ А ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РСФСР (72) Р,Д. Поздеева, В.В. Сочнее, П.Н. Сисягин, Н.И. Молявкин и Н,И. Гладышева (53) 576,8.094,29(088.8)(56) 1, ЧЧепсЬос Е,//Чзпа-Ч 1 гоз-аЬп 11 сЬе Рагсйе 1 п сег Кисцг чоп Рехоз сЬогосепзЕе 11 еп е 1 пег 2 еде п 11 с Ч 1 зпаЯутрсогпеп/ЙЫ.Чес.Мес., Вс. 21, з. 32.ТЬоггпаг Н.//Ап еессгоп гпсгозсоре зсосу о сззце со 1 согез п 1 ессеб вй чзпач 1 газ//Чго 1 оду. 1961, чо 1. 141. р.463.(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА ВИСНА-МЭДИ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к лабораИзобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к лабораторной диагностике висна-мэди овец, и может быть использовано для первичного выделения, идентификации, титрования вируса висна-мэди, накопления антигена при получении диагностических препаратов, а также сохранения антигенных и иммуногенных свойств вируса.Целью изобретения является повышение выхода вируссодержащего материала, упрощение и удешевление способа.П р и м е р 1, Для получения культуры клеток используют клинически здоровых, хорошо развитых ягнят 1-15-дневного возраста. Баранчиков кастрируют в хозяйстве открытым способом по общепринятой метоторной диагностике вируса висна-мэди овец, и может быть использовано для первичного выделения, идентификации, титрования вируса висна-мэди, накопления антигена при получении диагностических препаратов, а также сохранения антигенных и иммуногенных свойств вируса, С целью повышения выхода вирусосодержащего материала, упрощения и удешевления способа вирус культивируют в культуре клеток тестикулятов ягнят 1 - 15-дневного возраста, с использованием питательных растворов - 0,5-ного гидролизата лакто.альбумина на растворе Хенкса и среды Игла в соотношении 1:1, а заражение культуры клеток вирусосодержащей суспензией осуществляют дважды с интервалом 24 - 48 ч. 2 табл.дике. Стерилизацию проводят в первой половине рабочего дня. Ягненка фиксируют спинкой вниз. Кожу мошонки дезинфицируют, стерильными ножницами вскрывают мошонку, захватив анатомическим пинцетом, подтягивают один из тестикулов, перевязывают стерильной шелковой нитью семенной канатик и отрезают его, Так же получают второй тестикул.Извлеченные тестикулы помещают в стерильный флакон, содержащий 100 - 150 мл среды Хенкса с антибиотиками (пенициллин 500 ЕД/мл, стрептомицин 500 мкг/мл) и доставляют в лабораторию.После доставки материала тестикулы тщательно (4-5 раэ) промывают раствором Хенкса с антибиотиками, переносят в чашкуПетри, удаляют белочную оболочку и патологически измененные участки, разрезают тестикулы вдоль, вылущивают ткань и измельчают ее острыми ножницами до размеров частиц 1-3 мм, Измельченную ткань переносят в колбу для трипсинизации, промывают (4-6 раз) раствором Хенкса с антибиотиками для удаления обрывков ткани иэритроцитов.Измельченную и промытую ткань заливают диспергирующей жидкостью (смесь 0,25;-ного раствора трипсина и 0.02-ного раствора версена в соотношение 9:1), подогретойдо 37 С, после чего в колбу опускают стерильный магнит и ставят ее на магнитную мешалку, Дезагрегацию ткани проводят дробно с интервалом 7 - 10 мин до полного истощения ткани при комнатной температуре. Для инактивации трипсина в полученную суспензию добавляют 5; сыворотки крови беэ консерванта. После каждого слива флакон с суспензией клеток помещают в холодильник. Взвесь клеток центрифугируют в течение 10 мин в рефрижераторной центрифуге при 800 - 1000 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в небольшом(30 - 50 мл) объеме подогретой до 37 С питательной среды, содержащей 0,5-ный гидрализат лактоальбумина на растворе Хенкса и среду Игла в соотношении 1;1 с добавлением 15 - 20; сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков,Полученную концентрированную клеточную суспенэию тщательно перемешивают и отбирают 0,2 мл для подсчета числа клеток в камере Горяева. Окрашивают 0,5;4-ным водным раствором трипанового синего, выдерживают 5 мин и заряжают камеру Горяева.Полученную при дезагрегации ткани концентрированную суспензию клеток разводят ростовой средой до 250 - 300 тыс. клеток в 1 мл, При трипсинизации одной пары тестикул ягнят 1-15-дневного возраста получают 110-140 млн живых клеток,Посевы культур клеток проводят в пробирки и матрасы, делают отметку верхней поверхности засеянных сосудов с указанием наименования ткани и даты посева, помещают в термастат при 37 С в горизонтальном положении. Через 18-24 ч инкубирования образуются островки клеток различной величины, Через 24-48 ч для поддержаня роста клеток проводят смену ростовой среды. Ростовую культуру помещают в термостат при 37 С. Сплошной монослой .клеток тестикулов ягнят 1 - 15-дневного возраста образуется на 3-5 сут. Жизнеспособность клеток 90-95. 10 15 20 25 30 35 45 Пересев клеток осуществляют после образования сплошного монослоя, Для этого иэ матраса с выросшим монослоем клеток удаляют питательную среду, монослой промывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиками пенициллин 100 Ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл) для освобождения от сыворотки, после чего вносят подогретую до 37 С смесь растворов версена 0,02 с трипсином 0,25 в соотношении 9:1, После смачивания монослоя половину жидкости сливают, матрасы помещают в термостат на 5 - 10 мин при 37 С. После отделения клеток от стекла во флаконы вносят питательную среду с добавлением 10-15 сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков, Сыворотку предварительно инактивируют при 56 С в течение 30 мин, Полученную суспензию клеток пересевают бесцентрифужным способом с коэффициентом пересева 1:1,5 - 1:2.При субкультивировании используют концентрацию клеток 200 - 250 тыс,/мл. Монослой формируется через 3 - 5 сут.Первично трипсинизированные клетки тестикулов ягнят не обнаруживают резких различий по структу;.е монослоя и представ- лень. клетками зпителио- и фибробластоподобнэго типа, На окрашенных препаратах эпителиоподобные клетки имеют полигональную форму, границы клеток плотно примыкают друг к другу. Ядро клеток крупное. округлой формы с ядрышками. Количество ядрышек от 3 до 5, реже больше.Хроматин ядра имеет крупносетчатую структуру, цитоплазма - с мелкой вакуолизацией. Фибробластоподобные клетки имеют форму веретена или вытянутой пирамиды, удлиненное ядро и многочисленные ядрышки. Митомический индекс в культурах подсчитывают по общепринятой методике, Величина митотического индекса в культуре клеток тестикулов ягнят 1 - 15-дневного возраста изменяется о. 12,4 в первые дни культивирования до 25,5; на 3 - 4 сут роста, Средний митотический индекс составляет 22 25 о П р и м е р 2. Перед заражением монослойные культуры клеток просматривают макро- и микроскопически. Макроскопически среда в культуральных сосудах должна быть прозрачной, иногда с легкой опалесценцией, красновато-розового цвета; мик. роскопически культура должна покрывать культуральную поверхность стекла сплошным пластом с преобладанием эпителиоподобных клеенок.Заражение культур клеток проводят следующим образом.1"."94 5 Таблица 1 Чувствительность культуры клеток тестикуловягнят в зависимости от возраста Первичная культура клеток тестикулов ягнят16-45-дневноговозраста Показатель Первичная культурклеток тестикуловягнят 1 - 15-дневного возраста 70-100 10 о 50-6022-25 12-13 3-5Смешанного типа с преобладанием эпителиоподобных106-7Смешанного типа спреобладанием эпит елоро о б ных 10Титр вируса, ТЦД Ростовую среду из сосудов сливают, монослой клеток отмывают от сыворотки, ополаскивая его трижды раствором Хенкса с антибиотиками, вносят 10-ную суспензию вирусосодержащего материала в объеме 20 ф от количества питательной среды, оставляют на 2 - 3 ч для контакта при 37 С.После этого матрас освобождают от внесенной суспензии и заливают в него поддерживающую среду. Инкубируют в течение 24-48 ч при 37 С.Для ускорения проявления цитопатического действия вируса, повышения титра его накопления проводят повторное внесение в сосуд с культурой клеток вирусного материала. Для этого культуру клеток тестикулов ягненка освобождают от питательной среды, вносят 100-ную суспензию вирусосодержащего материала, оставляют на 2 - 3 ч при 37 С. После этого удаляют суспензию из матрасов и вносят поддерживающую среду, Инкубируют при 37 С.Вирус висны-мэди репродуцируется спроявлением цитопатического действия, началом которого в семенной клеточной культуре считают образование округлых и веретенообразных одноядерных клеток, за, тем многоядерных симпластов, которые на неокрашенных препаратах выглядят как звездчатые гигантские клетки с большим количеством отростков. Характерной чертой поликариоцитов в инфицированной культуре клеток является концентрирование ядер в розетки. Наиболее характерные признаки Выход клетокЖизнеспособность, Е Средний митотический индекс, ЕВремя формирования монослоя, сут.Структура монослоя цитопатического действия при выделениивируса висны-мзди из патологического материала от больных овец кусочки легких,Б мозга, региональные лимфатические узлы,кровь) отмечают на 4 - 6 пассажах, При заражении вирусом висны-мэди клеточной культурц тестикулятов ягнят 1 - 15-дневноговозраста вновь синтезированный вирус об 10 наруживают на 42 ч после инокуляции. Титрвируса возрастает к 60 часу и достигает максимального значения на 120 ч после инокуляции. Титр виоуса висны-мзди составляет0 65 ТЦД 50, л.15 П р и м е р 3, Данные, касающиесячувствительности культур клеток тестикуловягнят в зависимости от возраста, приводятся в табл. 1,П р и м е р 4. Сравнительные данные20 средних величин основных показателей эффективности данного и известных способовкультивирования вируса висны-мэди приводятся в табл. 2. 25 Формула изобретенияСпособ культивирования вируса виснамэди, включающий внесение вирусного материала в культуру клеток, выращиваемую на питательной среде, о т л и ч а ю щ и й с я 30 тем, что, с целью повышения выхода вирусосодержащего материала, упрощения и удешевления способа, в качестве культуры клеток используют тестикулы ягнят 1-15- дневного возраста, а внесение вируса осу ществляют двукратно с интервалом 24-48 ч.1659475 7 Таблица 2 Сравнительная эффективность предлагаемого и известных способов культивирования вируса висны-мэди Предлагаемый способ Показатель Известный способ хороидное оп-. первичная культуралетение голов- клеток тестикуловного мозга эмбриона овцы первичная культура клетоктестикулов ягнят 1-15-дневного возраста 110-140 10б й1-4 10 70-75 10б80-87 90-95 30-50 22-25 18 6-8 3-5Смешанного типа с преобладанием эпителиоподобных 4-5Смешанного типа с преобладанием фибробластоподобных10 7-10Фибробластоподобного типа 10Титр вируса,Т 1 Щэ,Характеристика цитопатическогодействия Составитель И.Тареева Редактор Л,Герасимова Техред М,Моргентал Корректор М.КучеряваяЗаказ 1820 Тираж 381 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 ВыходклетокЖизнеспособность,Средний митотический индекс, ХВремя формирования монослоя, сутСтруктура монослоя Образование округлых и веретенообразных одноядерных клеток, а такжемногоядерных симпластов, которыена неокрашенных препаратах выглядят как звездчатые гигантские клетки с большим количеством отростков.Ядра поликарциоцитов концентрируются в розетки