Способ получения глюкоамилазы

(ц 556173 Союз Советских Социалистических РеспубликЕТЕЛЬСТВ ВТОРСКОМ 1 Лополнителеп авт 960136/1 2) Заявлено 21.09 М. Кл. С 120 13/1 О с присоединением з Государственный комитеСовета иинистров СССРВо делам иаааретенийи открытии) Приоритет Об лк о в я0,04.77. Бол 53) УДК 577.15.663) Заявитсл Иностр титут фюр ди ТехнишеФоршунгс ЛЮКОАМИЛАЗЫ И 4) СПОСОБ ПО Изобретение относится к способам получения глюкоамилазы, используемой при ферментативном превращении крахмала.Известен способ получения глюкоамилазы, предусматривающий культивирование Епдотпусорзтз Ьзрога на производственной питательной среде, содержащей обезжиренные соевые бобы, крахмал и бифосфат калия 1),Получаемый таким способом фермент имеет невысокую активность, а сам процесс его получения длителен,Ближайшим решением к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является известный способ получения глюкоамилазы, предусматривающий культивирование Еп 1 отпусорзтз Ызрога яа производственной среде, содержащей крахмал, кукурузный экстракт и фосфорнокислый калий 2.Но процесс культивирования фермента по указанному способу длителен, а его выход невысок, При культивировании в течение четырех суток получают глюкоамилазу активностью с 70 - 80 1 Е/мл (международных ед/мл) фильтрата, а после 5 - 6 суток повышения актвности не наблюдается.Цель изобретения - повышение активности фермента и сокращение продолжительности процесса,остр анцытрред Тойфель, Фритц Циклер,х Ширбаум, Манфред Рихтер,ер и Клаус Ридель(ГДР)анная фирмаГэруигсиидустри Энцимологи унМикробиологи(ГДР) Для этого по предлагаемому способу получения глюкоамилазы, предусматривающему культивирование Епдотпусорзтз Ызрога на производственной питательной среде, содержащей крахмал, кукурузный экстракт и фосфорнокислый калий, указанную производственную питательную среду перед началом культивирования вносят токоферолсодержащее вещество в количестве 500 - 2000 мг/г, о преимущественно 500 - 1000 мг/г, а культивирование осуществляют при расходе 1,0 - 1,4 л воздуха в 1 мин.Способ осуществляют следующим образом.На производственной питательной среде, соб держащей крахмал, кукурузный экстракт,фосфорнокислый калий и токоферолсодержащее вещество, в качесгве которого используют от 0,5 до 5,0% растительного масла или животного жира, например рисовое, рапсовое, О кукурузное или соевое масло, свиное сало илирыбий жир, культивируют Епдогпусорзтз Ыз.рога. Токоферолсодержащее вещество вносят в производственную питательную среду перед началом культивирования в количестве 5 500 - 2000 мг/г, преимущественно 500 -1000 мг/г, а культивирование осуществляют при расходе 1,0 - 1,4 л воздуха в минуту.П р и м е р 1, На четырехнедельной культуре косого агара по Викерхаму от Епдотпусор556173 5 10 15 Т аб лица 1 Активность глюкоамилазы, 1 Е/мл Длительность культивирования, добавка 3% рапсового масла без определяемого перекисного числадобавка Зоо рапсового масла с перекисным числом 0,723 71 103 115 158 209 225 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 6,5 з 1 в Ыврога получают 3 - 4 мл затравочной суспензии (физиологический раствор поваренной соли); 0,5 - 1,0 мл этого раствора добавляют к 20 мл среды по Викерхаму. Инкубируют 48 - 72 час при 25 С 1 мл этой суспензии, переводят ее в качалочную колбу объемом 500 мл, в которой находится 100 мл доведенной до рН 5,0 водной суспензии, содержащей ( /о): жидкий кукурузный экстракт 2,0 (50 /о сухого вещества); КН,РО 0,5 и кукурузный крахмал 1,0, и 24 час при 25 С встряхивают при 200 об/мин. Затем 1 мл этой культуры,в форме мицелия переносят в качалочную колбу объемом 500 мл, в которую предварительно помещают при рН 5,0 100 мл водной суспензии, содержащей (%): жидкий кукурузный экстракт 2,0; рапсовое масло 3,0; кукурузный крахмал 1,0; КН,РО 4 0,5 и встряхивают в течение 5 дней при 200 об/мип. П р и м е р 4. На восьминедельной культуре косого агара Епдовусорв 1 з 1 иврога при помощи петли переводят мицелий, размером около 1 мм, в среду по Викерхаму (20 мл) и инкубируют 100 ч при 25 С. Образующуюся суспензию мицелия переводят в круглодонную колбу объемом 2 мл с 400 мл питательной среды, содержащей (%): кукурузный крахмал 1,0; кукурузный экстракт 1,0; КНРО 0,5, и при рН 5,0 инкубируют 24 ч при 28 С на качающемся столе.Затем содержимое колбы используют для затравливания 20 л производственной пита 40 45 50 55 60 65 4Активность глюкоамилазы при культивировании в течение 3 дней составляет 101,5 1 Е/мл, в течение 4 дней - 159,4 1 Е/мл.П р и м е,р 2. Процесс осуществляют по методике примера 1, за исключением того, что в производственную питательную среду вносят 3% свежего масличного жмыха от производства кукурузного масла.Активность глюкоамилазы при культивировании в течение 4 дней составляет 118,5 1 Е/мл, в течение 5 дней - 158,5 1 Е/мл.П р и м е р 3. Процесс осуществляют по методике примера 1, за исключением того, что в производственную питательную среду вносят 3/о рапсового масла без определяемого перекисного числа и для сравнения - добавку рапсовых масел с перекисными числами 0,7 и 1,6.Результаты испытаний приведены в табл. 1. тельной среды в стеклянном ферментационном сосуде.Производственная питательная среда содержит (%); жидкий кукурузный экстракт 1,0; крахмал 1,0; рапсовое масло 1,0; КНяРО 4 0,5. рН среды 5,3, температура 30 С, аэрация 1:1 (спаренная мешалка - 340 об/мин),Результаты испытаний приведены в табл.2.Прим ер 5. Процесс осуществляют по методике примера 1, но в производственную питательную среду вносят 3% свиного сала с добавкой 1000 мг токоферола на 1 г жира.Активность глюкоамилазы при культивировании в течение 3 дней составляет 731 Е/мл, 4 дней - 110 1 Е/мл, 5 дней - 162 1 Е/мл.П р и м ер б. Процесс осуществляют по методике примера 1, но в производственную питательную среду вносят 3% рыбьего жира (тунца, макрели) с добавкой 500 мг токоферола,на 1 кг жира.Результаты испытаний приведены в табл. 3.П р и м е р 7. Восьминедельную культуру Епдогпусорз 18 Ызрога, выращенную на косом агаре, при помощи петли переносят в одно- миллиметровую грибницу в 20 мл среды по Викерхаму и инкубируют 100 час при 25 С.Образовавшуюся суспензию переносят в двухлитровую круглодонную колбу с 400 мл питательной среды, содержащей (%): куку556173 Таблица 3Активность глюкоамилазы, 1 Е/мл Таблица 4 Активность глюкоамилазы, 1 Е/мл Длительность культивирования, Длительность культивиро 5 вания, дни с добавкон 3% рыбьего жира и 500 г токоферола на 1 г жира без добавки рапсового масладни 38,0 48,0 112,8 185,2 52 59 55 54 77 151 10 Формула изобретения 15 Составитель А. БражниковаРедактор Н. Хубларова Техред М, Семенов Корректор Л, Денискина Заказ 112/7 Изд, Мо 421 Тираж 560 Подписное Ц 11 ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунов:ч 2 рузная вода набухания 1,0; кукурузный крахмал 1,0; КНРО 4 0,5. Инкубируют (при рН 5,0) 24 ч при 28 С ,на вибрационном столе, после чего содержимое колбы инокулируют в 20 л производственной среды, содержащей (% ): кукурузная вода,набухания 2,0; кукурузный крахмал 1,0; КНяР 04 0,5, при рН 5,0, Перед началом ферментации добавляют 1% рапсового масла в качестве токоферолсодержащего вещества (950 мг токоферола на 1 г масла), для чего используют стеклянный прибор. Ферментацию проводят при 30 С, аэрации в ходе фазы роста грибницы - до 24 ч ферментации - 1:1 (20 л воздуха в 1 мин) и затем 1,0: 0,5 до 0,8 (10 - 16 л воздуха в 1 мин) на сдвоенной мешалке.Результаты испытаний приведены в табл, 4.Описываемый способ получения глюкоамилазы по сравнению с известным обеспечивает повышение активности фермента при сокращении продолжительности процесса в 1,5 - 3,0 раза. Способ получения глюкоа мил азы, предусматривающий культивирование Епдогпусоряз Ьзрога на производственной питательной 20 среде, содержащей крахмал, кукурузный экстракт, и фосфорнокислый калий, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности фермен га и сокращения продолжительности процесса, в производственную 25 питательную среду перед началом культивирования вносят токоферолсодержащее вещество - 500 - 2000 мг/г, преимущественно 500 - 1000 мг/г, а культивирование осуществляют при расходе 1,0 - 1,4 л воздуха в 1 мин.30 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. Патент Франции Мо 1380854, кл. С 12 Р,1965.2, Патент ГДР Мя 60536, кл. 6 а 22/04, 35 1969 (прототип).