Способ определения формы холерных вибрионов

(54) СОСОБ ОПРЕДЮ 1 ЕНИЯ ФНЫХ ВИБРИОНОВ(57) Изобретение относитебиологии, Цель изобретениние и упрощение способа.алъную взвесь добавляют трглиоксилат, ацетил-коэнэимшинают и после инкубированосновной фенклгидразин. Поноя и охлаждения н смесь дсоляную кислоту и краснуюсоль. По интенсивности окропределить формы холерныхв течение 30 мин, 1 табл.(22) 18, 1 (71) Рост ный научи чумный ин (72) Л.А. Ю.М.Ломов (53) 612. (56) Г 1 еха ти холерн ну, 1981,ствен отиво к микро" ускоребактеритои ХЛ.Е.Асеева,ко и Б, Д.Рублевпазон изменчитосн, Ростов-на-Доперем ия вводятсле кипячеобавляют кровянуюаски можнвибрионов ной бан темпера ной кисл кровяно эультат рез 1-2 Изобской м омнатноимоль соляаждения до 0,25 - 1)0 4-16 мкмолзе 4таблицу) интенсивн и о уры оты н кр У ровет редят че окраск соли в (см..чтобы в конечнлись следующиетов, добавляемьвательности: 5ток, 0,5 мг трмоль глиоксилаКоА, после тща нания при 37 бходимое для с глиоксилаго фенилгидра инкубир емя, не тил-КсА и 15-минутного (минимальное в конденсации ац том) - 5 мкмол яосновн ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИГННт СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ ретенис относится к медицинкробиологии, а именно к методам диагностики холеры.Целью изобретения является ускорение и упрощение способа.Цель достигается тем, что дифференциацию измененнь;х форм холерных вибрионов пронодят по определению ак тинности фермента малат-синтаэы (К.ф 4.13.2).Способ осуществляют следующим образом.Иэ, колоний клеток отбирают 2 петли материала (что соответствует 5 млрд. микробных клеток) и готовят взвесь н,0,2 мл буферного раствора (трис-НС 1, рН 7,4), добавляют последовательно растворы компонентов с таким расчетом, чтобы в конечном объеме 1 мл содержалось: 5 млрд. микробных клеток, 0,05"0,3 мкмоль глиоксилата, 0,2 0,3 мкмоль ацетил-КоА, после 15-30 й минутного икубирования при 37 С - 5-15 мкмоль основного фенилгидраэина, после доведения до кипения на вод Иэ подозрительных ют 2 петли материала 5 млрд, микробных кле мл буферного раство,2 М трис-НС 1, рН 7,4) бактериальную взвесь. твори приливаемых иновят с таким расчетом, ом объеме 1 мл содержа- количества компоненте в указанной последомлрд. микробных клеитона Х, 0,05 мкта, 0,2 мкмоль ацетилтельного перемешинаниязина, после доведения до кипения на водяной бане и охлаждения до комнат- ной температуры - 0,25 ммоль соляной кислоты и 4 мкмоль красной кро-: вяной соли КРе(СБ) 1. 11 рн использо, 5 ванин данных концентраций предлагае мой смеси через 1-2 мин у гладких 8-форм холерных вибрионов окраскаотсутствонала, К-Формы окрашивались в. бледно-розовый цвет, а у Л-форм наблюдалось красное окрашивание, свидетельствующее обобразовании фенилгидраэона глиоксиловой кислоты.П р и м е р 2, Иэ подозрительных колоний отбирают 2 петли материала (соответствует 5 млрд. микробных клеток) и в 0,2 " 0,4 мл буферного растнора (например, 0,15 М ХЕПЕС; рН 7,4) приготавливают бактериальную взвесь, Рабочие растворы приливаемых ингре" диентов готовят с расчетом, чтобы в , конечном объеме 1 мл содержались следующие количества компонентов, добавляемые в указанной последова-. тельности: 5 млрд. микробных клеток,.1,0 мг тритона Х"100, 0,2 мкмоль глиоксилата, 0,25 мкмоль ацетил-. КоА, после перемешивания и 30-минутногооинкубирования при 37 С (максимальное время, необходимое для конденсации ацетил-КоА с глиоксилатом) - 10 мкмоль основного Фенилгидраэина, после кипячения на водяной бане и охлажде ння до комнатной температуры - 0,5 ммоль соляной кислоты и 8 мкмоль красной кровяной соли. Учет резуль" татов проводят через 1-2 мин. У гладких Б-форм окраска не развивается, что говорит о наличии у них фермента малатсинтазы. Проба с Л-трансформиро 40 ванными клетками мгновенно окрашивается в красный цвет, а проба с К-Формами - в розоный цвет что свидетельствует об отсутствии фермента малатсинтазы у Л-форм и ггизкой его актив 45 ности у К-Форм холерных вибрионов.П р и и е р 3. Из подозрительных колоний отбирают 2 петли материала (соответствует 5 млрд. микробных клеток) и н 0,2"0,4 мл буферного раст" вора (например, О, 1 М МОПС; рН 7,4) приготавливают бактериальную взвесь. Рабочие растворы приливаемых ингредиентон выбирают с расчетом, чтобы вконечном объеме 1 мл содержались сле"дующие количества компонентов, добавляемые в указанной последовательности; 5 млрд. микробных клеток, 1,5 мгтритона Х, 0,3 мкмоль глиоксилата, 0,3 мкмоль ацетил-КоА, после перемешинания и 15"минутного инкубирования прн 37 С - 15 мкмоль основногофенилгидраэина, после кипячения наводяной бане и охлаждения до комнатной температуры - 1,0 ммоль солянойкислоты и 16 мкмоль красной кровянойсоли,)При учете результатов через 1"2 мин у гладких В-форм окраска не появляется, н связи с тем, что образуется малат, который не дает цветногокомплекса с Фенилгидразнном нКоГе(СЯ) , У К-Форм мгновенно появляется малиновая окраска, а у Л-Формхолерных вибрионов окрашиваются в ярко-красный цвет, что свидетельствуетоб образовании Фепилгидраэона глиоксилоной кислоты.Способ. позволяет в течение 30 мин(по сравнению с 3 сутками в прототипе) определять Формы холерных вибрионов,Формула изобретенияСпособ определения Формы холерных вибрионов путем приготовления взвеси клеток исследуемых вибрионов и обра" ботки ее реагентами с последующей регистрацией результата прошедшей реакции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, взвесь содержит 5 млрд. микробных клеток, а обработку проводят 0,5-1,5 мг тритона Х, 0,05- 0,3 мкмоль глиоксилата, 0,2"0,3 мк" моль. ацетил"коэнзима А в течение 15- 30 мин, затем добавляют 5-15 мкмоль основного Фенилгидразина смесь донодят до кипения, охлаждают, добавляют к ней 0,25-1 ммоль соляной кислоты и 4"16 мкмоль красной кровяной соли и при сохранении исходной окраски смеси огределяют Я-форму, ярко-красном окрашинании смеси Л-форму, розовом окрашинанин К-форму,