Способ получения хромогенного субстрата для определения хитиназной активности

. 3, й. 10, р.805,Яегге 1 1 ацпеге СЯресйс аззау о 1г 1 ехтпп 6-91 цсапоЬуого,азе цз 1 п 9 1 аЬеебПцап, - Апа 1, В 1 осего, 1990, ч.186, М. 2,. 12 - 315.НаЕгпап б,М Со 1 с 1 Ьег 9 М, йеыЬзтга 1 ез айаг цзе МтЬ СлЮпазез. - Апа 1,В осЬец, 1964, м.8, М 3, р,397-401,Изобретение относлтся к способам полу ения окрашенных соединений и может быть использовано в энзималогии, микробалогической промышленности в качестве субстрата для определения хитиназнай ак. тивности в ферментных препаратах и биологических средах.Хитинолитические ферменты являются о ьектом углубленных исследований, пас ольку во многом определяют пути превраений и утилизации хитина в природе, Не м нее важным является значение хитиназ, к к ферментов, способных расщеплять хитин в составе патогенных грибов и насекомых. Тем самым, хитиназы (или композиции1 н) их основе) являются готенциальными энт мопатогенными и противомикозными и паратами, В связи с лзлаженным, разра(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ 1 ИЯ ХРОМОГЕННОГО СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ(57) Использование: энзимология, микробиологическая промышленность в качестве субстрата для определения хитиназной активности в ферментных препаратах и биологических средах, Сущность изобретения: осуществляют окрашивание коллоидного хитина тиазиновым или винилсульфоновым красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы в концентрации 0,1-0,25 М, путем инкубирования реакционной смеси при 100 С в течение 10-30 мин. При этом краситель преимущественно берут в концентрации 10 - 15 мас,%, 1 з,п,ф-лы, 4 ил,1вел ботка аналитических способов для идентификации и тестирования хитиназ является актуальной.Известен ряд способов анализа хити- Ь 3 наэной активности, Все они основаны на фъ, определении растворимых продуктов расщепления хитина хитиназами, Однако боль- (р шинство из эти способов обладает существенными недостатками: низкой чув- с ствительностью, недостаточной специфич- ф ностью, а также использованием при бд подготовке и проведении анализа высокотоксичных или радиоактивных соединений,Наиболее простыми и специфичными являются способы тестирования активности хитиназ с использованием хромогенных субстратов, в которых исходные полимеры хитина модифицируют(окрашивают) ромо 17924285 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 генными группировками. Результаты анализа хитиназной активности определяют после окончания хитиназной реакции пооптической плотности фильтратов реакционных смесей,Известен, например, способ полученияхромогенного субстрата путем модификации полиглюканов (пуллулана, крахмала)триазиновыми или винилсульфоновымикрасителями в присутствии сульфата натрияи ортофосфата натрия в течение 2 часов притемпературе 50 С.Однако такой субстрат для определенияхитиназРбй активности непригоден, поскольку не расщепляется хитинолитическими ферментами,Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения хромогенного субстрата для анализахитиназной активности, заключающийся вследующем,Взвешивают 1 г порошка нативного хитина, просеянного через сито 200 меш; кнавеске хитина добавляют 50 мл 1;4-ногораствора триазинового ("Процион красныйЖ") или винилсульфонового("Ремазол яркоголубой Р" или "Ремазол ярко-фиолетовый5 Р") красителя в 1 М КаОН; полученную суспензию инкубируют 5 мин при температуре100 С (на кипящей водяной бане); послеэтого суспензию инкубируют ночь при комнатной температуре; после этого окрашенный хитин промывают дистиллированнойводой для удаления несвязанного красителя; после этого окрашенный хитин промывают дополнительно этанолом идиэтиловым эфиром; после этого окрашенный хитин высушивают и используют какхромогенный субстрат для анализа хитиназ.Хромогенные субстраты для анализа хитиназ производятся по способу-прототипуфирмами США "Сигма" и "Калбиохем",Данный хромогенный субстрат характеризуется эффективностью 0,036. Длительность процедуры синтеза - 10-12 часов.Эффективность хромогенного субстратаопределяют следующим образом, Реакционную смесь, содержащую хромогенный субстрат (3 мг/мл) и хитиназу изЯсгерсопусез цг 1 зецз (0,2 мг/мл) в 0,05 Мацетатном буферном растворе (рН 5,5) инкубируют при температуре 25 С в течение 18часов. После этого реакционную смесь центрифугируют (3000 об/мин, 10 мин), надосадочную жидкость собирают. Оптическаяплотность надосадочной жидкости при длине волны, характерной для используемогокрасителя, является эффективностью хромогенного субстрата. Основным недостатком прототипа является низкая эффективность хромогенного субстрата. Для увеличения эффективности субстрата в прототипе предлагается использовать в качестве исходного полимера вместо альфа-формы хитина его гамма-форму, которая быстрее расщепляется хитиназами. Такое решение нельзя признать удовлетворительным, поскольку в природе встречается в основном альфа-форма хитина, а гамма-хитин обнаружен только в коконах некоторых жуков и в панцырях отдельных видов моллюсков, В связи с этим, гамма-хитин труднодоступен и не может найти повсеместное применение.Дополнительным недостатком прототипа является многостадийность и длительность способа синтеза хромогенного субстрата,Целью изобретения является увеличение эффективности хромоген ного субстрата и упрощение способа его синтеза,Это достигается тем, что в качестве исходного полимера используют коллоидный хитин, который модифицируют триазиновым или винилсульфоновым красителем в растворе, содержащем гидроксид-ионы в концентрации 0,1 - д,25 М, путем инкубирования реакционной смеси при температуре 100 С в течение 10 - 30 мин. При этом краситель преимущественно берут в концентрации 10-15%.Сущность предлагаемого способа заключается в следующем:к коллоидному хитину добавляют раствор, содержащий гидроксил-ионы в концентрации 0,1-0,25 М и триазиновый или винилсульфоновый краситель в концентрации 10-15%;полученную суспензию инкубируют на кипящей водяной бане при температуре 100 С в течение 10 - 30 мин;окрашенный хитин отмывают дистиллированной водой от несвязавшегося красителя и используют в качестве хромогенного субстрата для анализа хитиназной активности,Получаемый хромогенный субстрат в зависимсти от вида используемого красителя характеризуется эффективностью 0,55 - 1,2, Длительность процедуры синтеза составляет 30 - 40 мин,Существенными отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются следующие,В качеСтве исходного полимера используют не нативный, а более гидрофильный коллоидный хитин, что позволяет увеличить эффективность хромогенного субстрата в 10-13 раз. Коллоидный хитин значительно5 10 15 20 25 более чувствителен к действию хитиназ, чем нативный хитин. При этом, повышенная гидрофильность позволяет более эффективно модифицировать коллоидный хитин молекулами красителя, Хромогенный субстрат, порученный из коллоидного хитина в условиях прЬтотипа, обладает эффективностью 0,3-0,4.В звестных научно-технических источниках ис ол ьзова н ие колл оидно го хитина в качестве ис одного полимера для модификации триазино ыми или винилсульфоновыми красителями с елью получения хромогенного субстрата " дл тестирования хитиназной активности не об аружено,Модификацию хитина проводят в раств ре, содержащем гидроксил-ионы с конц нтрацией 0,1 - 0,25 М, что позволяет по ысить эффективность хромогенного субст ата, по сравнению с прототипом, в 1,5 ра а, На фиг,1 представлена зависимость от осительной эффективности хромогенного субстрата от параметра рХ, где рХ опреде яется из концентрации гидроксил-ионов (С н-) поформуле: рХ =14+19 Сон-. Изфиг.1 ви но, что при значениях рХ меньше 13 (С н- = 0,1 М) и больше 13,4 (Сон- = =0,25 М) э фективность хромогенного субстрата сн жается более, чем на 10 от максимально (Сон-= 0,15 М). Представленная на фиг,1 за исимость воспроизводится при использо ании в качестве источника гидроксили нов различных гидроокисей (калия, на рия, лития), В известных научно-т хническ х источниках использование заявляемого ди пазона концентраций гидроксил-ионов дл модификации молекул хитина триазиновыми или винилсульфоновыми красителями не обнаружено.Длительность инкубирования реакцион ой смеси при температуре 100 С (на кипя ей водяной бане) составляет 10 - 30 мин, чт позволяет увеличить эффективность хр могенного субстрата. по сравнению с пр тотипом, еще в 1,25 раза и упростить сп соб получения хромогеннного субстрата дл тестирования хитиназ за счет сокращени количества стадий (на 4 стадии), сокращ ния длительности синтеза хромогенного су страта с 10 - 12 часов до 30 - 40 мин, а та же исключения из способа пожароопаснь х реагентов (этанола, диэтилового эфира,На фиг.2 представлена зависимость отно ительной эффективности хромогенного су страта от продолжительности инкубирова ия реакционной смеси при температуре 10 С. На фиг 2 видно, что сокращение прадо жительности инкубирования менее 10 м н приводит к уменьшению эффективност хромогенного субстрата более, чем на30 35 40 45 50 55 10 О от максимального значения (при длительности инкубирования 25-30 мин). Увеличение продолжительности инкубирования более 30 мин нецелесообразно, поскольку не приводит к дальнейшему повышению эффективности хромогенного субстрата.Посла проведения синтеза хромогенного субстрата в заявляемых условиях, дополнительного инкубирования реакционной смеси при комнатной температуре в течение ночи, как предлагается в прототипе, не требуется. Дополнительное инкубирование реакционной смеси при комнатной температуре.в течение 0-18 часов не изменяет эффективности заявляемого хромоген ного субстрата,В известных научно-технических источниках использование заявляемой продолжительности инкубирования реакционной смеси при температуре 100 С для модификации хитина триэзиновыми или винилсульфоновыми красителями не обнаружено,Триазиндвый или винилсульфоновый краситель преимущественно используют в концентрации 10-15 О что позволяет получить дополнительный положительный эффект, заключающийся в увеличении эффективности хромогенного субстрата в 1,5 - 2,5 раза. Умен ьшен ие кон центрации красителя ниже 10-15 О приводит к снижению эффективности хромогенного субстрата. Увеличение концентрации красителя выше 10-15 нецелесообразно, поскольку указанная концентрация близка к насыщающей для данных красителей и ее дальнейшее повышение затрудняетотмывку хромогенного субстрата от несвязавшегося красителя и, тем самым, усложняет способ получения,хромогенного субстрата для тестирования хитиназ,На фиг,З представлены сравнительные данные по эффективности заявляемых хромогенных субстратов (1 - 4) и эффективности прототипа (5), где для синтеза хромогенных субстратов использовали: 1 - триазиновый краситель "Реактив красный 4" (фирмы "Сигма" ); 2 - триазиновый краситель "Процион ярко-голубой М-Р" (фирмы "Серва" ); 3винилсульфоновый краситель "Ремазол ярко-фиолетовый 5 Р" (фирмы "Сигма" ); 4 и 5 - триазиновый краситель "Реактив красный 120" (фирмы "Сигма" ). Из фиг.З видно, что заявляемые хромогенные субстраты, получаемые с разными красителями, отличаются между собой по эффективности не более, чем в 2 раза, Такой разброс эффективностей, по-видимому, отражает различия красителей в спектральных свойствах и реакционных способностях. Тем не менее, все заявляемые хромогенные субстраты в15 - 30 раз превышают по эффективностисубстрат, полученный в условиях прототипа,На фиг,4 представлен линейный участокзависимости скорости гидролиза заявляемого хромогенного субстрата, модифицированного "Реактивом красным 120", отконцентрации препарата хитиназы изЯтгертоаусез цгзецз, Условия гидролиза:концентрация хромогенного субстрата 3мг/мл в 0,05 М ацетатном буферном растворе рН 5,5, температура 50 С, продолжительность реакции 30 мин, Из фиг.4 видно, чтозаявляемый хромогенный субстрат позволяет определять хитиназную активность вшироком диапазоне концентраций фермента,П р и м е р 1, К пасте коллоидного хитина, содержащей 1 г основного вещества (впересчете на сухой вес), добавляют 100 мл10-ного триазинового красителя "Реактивкрасный 120" в 0,15 М КОН и инкубируют втечение 30 мин при температуре 100 С (накипящей водяной бане), После окончанияинкубировэния осадок окрашенного хитинасобирают центрифугированием (3000об/мин. 10 мин) и промывают дистиллированной водой для удаления несвязавшегосякрасителя, К отмытому хромогенному субстрату добавляют дистиллированную воду,доводя общий объем суспензии до 100 мл(концентрация хромогенного субстрата око, ло 10 мг/мл), Эффективность хромогенногосубстрата - 1,2, Суспензию хромогенногосубстрата хранят в темноте при температуре 4-8 С в течение нескольких месяцев,П р и м е р 2. Получение хромогенногосубстрата осуществляют аналогично примеру 1, но окрашивание производят винилсульфоновым красителем "Ремазоломярко-фиолетовым 5 Р" с концентрацией 15 фв 0;15 М ИаОН. Эффективность хромогенного субстрата - 1,05.П р и м е р 3, Получение хромогенногосубстрата осуществляют аналогично примеру 1,.но модификацию коллоидного хитинапроизводят в 0,25 М МаОН; Эффективностьхромогенного субстрата - 1,08.П р и м е р 4, Получение хромогенногосубстрата осуществляют аналогично примеру 1, но модификацию коллоидного хитинапроизводят в 0,1 М КОН. Эффективностьхромоген ного субстрата - 1,08.П р и м е р 5. Получение хромогенногосубстрата осуществляют аналогично примеру 1, но реакционную смесь инкубируют втечение 10 мин, Эффективность хромогенного субстрата - 1,05.П р и м е р 6. Определение хитиназнойактивности (ХА) с помощью заявляемогохромогенного субстрата.А Ч 20 25 30 35 40 вляют аналогично примеру 6, но используютхромогенный субстрат, полученный по примеру 2, оптическую плотность измеряют придлине волны 560 нм (й = 0,36), а козффици 45 ент К принимают равным 1,4 мкмоль, ХАсоставляет 0,34 ед.акт,/мг,П р и м е р 8, Определение ХА осуществляют аналогично примеру 6, но в качестветестируемого препзратв используют хити 50 назу из Яегга 1 а гпагсезсепз, А = 0,26. ХАферментного препарата хитиназы из Яеггабатагсезсепз составлязт 0,22 ед,акт./мг.П р и м е р 9. Определение ХА осуществляют аналогично примеру 7, но в качестве55 тестируемого препарата используют хитиназу из Яегга 1 а гпагсезсепз. А = 0,23. ХАсоставляет 0,22 ед,акт./мг,Использование предлагаемого способапозволит по сравнению с прототипом 5 10 15 В две пробирки приливают по 1 мл 1- ной суспензии хромогенного субстрата, полученного по примеру 1, по 0,6 мл 0,25 М ацетатного буферного раствора (рН 5,5) и 1,25 мл дистиллированной воды. В одну прсбирку (тест-проба) приливают 0,15 мл раствора ферментного препарата хитиназы из Ятгерсощусез цгзеы с концентрацией 0,5 мг/мл. В другую пробирку (контрольная проба) приливают 0,15 мл дистиллированной воды. Обе пробирки инкубируютс периодическим перемешиванием в течение 30 мин при температуре 50 С, После этого обе пробы центрифуги руют (3000 об/мин, 10 мин). Надосадочные жидкости собирают и измеряют в тест-пробе против контрольной пробы оптическую плотность при длине волны 512 нм, ХА определяют по формуле где А - оптическая плотность в тест-пробепри длине волны 512 нм (А = 0,4);Ч - обьем реакционной смеси, мл=30 мин); К - коэффициент пересчета оптической плотности в концентрацию й-ацетилглюкозамина, мкмоль (К = 1,6 мкмоль ),Зэ единицу ХА принимают такое количество фермента, которое в приведенных условиях реакции образует 1 мкмоль М-ацетилглюкозамина в минуту. ХА ферментного препарата хитиназы из Ятгер 1 огпусЕз цгзецз составляет 0,33 ед.акт./мг,П р и м е р 7, Определение ХА осущест9 1792428 10 б 0 10 увеличить эффективность хромогенного субстрата в 15-30 раз;упростить способ получения хромогенного субстрата за счет:а) сокращения количества стадий (на 4 5 стадии);б) сокращения длительности синтеза хр могенного субстрата с 10-12 часов до 3 - 40 мин;в) исключения из способа пожароопас нь х реагентов (спирт, эфир).Формула изобретения1. Способ получения хромогенного субст ата для определения хитиназной активност, включающий модификацию исходного 15 и имера триазиновым или винильсуфоноЩ вым красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы, инкубирование реакционной смеси при 100 С и отделение несвязавшегося красителя промыванием, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения эффективности целевого продукта и упрощения способа его получения, в качестве исходного полимера используют коллоидный хитин, модифицированный красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы в концентрации 0,1-0,25 М, а инкубирование реакционной смеси осуществляют в течение 10 - 30 мин,2. Способ пои.1, отлича ющийся тем, что краситель берут в концентрации 10 - 15 мас,о .1792428 100 05 Составитель А, дуж Техред М.Моргента Редактор орректор О,в аказ 169 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раущская наб., 4/5 роиэводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина. 101 30 о 6 ф бО 80 ЯЪгиефноагюг фига Фог,1