Способ получения окрашенного субстрата для определения целлюлазной активности

СО)ОЭ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН105605 33 52 ПИС ЗОБРЕТЕ ИДЕТЕЛЬСТВУ АВТОРСИ аЗ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 1(21 346341228-13(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии(Ьб) 1. Нцапд Вцпд Яап Тапд 7 огйап, Зепв 1 Ыче Аввау аког Се 11 ц 1 аве апй Оехггапаве.-1 Апа 1. В 1 осаещ., 1976, ч. 73, 9 2 р369-3772. Бс С 1 еагу В.Ч. Нею спгощодеп 3.с вцЬв 1 га 1 ев аког Юе аввау ог а 1 рЬа - ащу 1 аве апй (14)-Р-Э-д 1 цсапаве.1 СагЬ, ВевеагсЫф, 1980, ч, 86, р. 97-104.(54)(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКРАШЕННОГО СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ путем скрашиваниякарбоксиметилцеллюлозы активным красителем с последующим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюулучшения качества целевого продукта,повышения его выхода и упрощения процесса, окрашивание осуществляют красителем активным ярко-оранжевым ЖТ,взятым в количестве 20-200 от массыкарбоксимвтилцеллюлозы, а отделениенесвязанного красителя осуществляютс помощью диафильтрации,2, Способ по и. 1, о т л.и ч а ю- Ещ и й с я тем, что окрашивание осуществляется при 30-60 С.Изобретение относится к энзимологии, микробиологии и микробиологической промышленности и может быть ис" польэовано для определения целлюлаэной активности в ферментных препаратахи в биологических средах.Известен способ получения окрашен" ного субстрата для определения активности целлюлаэ, нключающий активиро" нание карбоксиметилцеллюлозы карбоди-)0 имидом и связнвание ее с хромофорными веществами через нитрофенильные группы 1).Недостатками способа являются необходимость активации карбоксиметилцеллюлозы карбодиимидом перед добав.лением хромОфорйых веществ, а также наблюдаемое снижение активности целлюлазы при взаимодействии с нитрофенильными группами.Наиболее близким к предлагаемому 20 по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получе- ния окрашенного субстрата для определения целлюлаэной активности путем окраш 1,вания карбоксиметилцеллюлоэы 25 активным красителем с последующим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, причем карбоксиметилцеллюлозу предварительно обрабатывают раст 30 вором целлюлазы.для частичной депо-. лимериэации, отделение несвязанного красителя проводят с помощью многократного переосаждения этанолом, содержащим 0,02 И КС 1, н качестве кра сителей используют ремазол ярко-чер; ный В или ремазол ярко-синий к при соотношении краситель-карбоксиметилцеллюлоза 1:1 по весу. Процесс окрашивания обычно осуществляют при 4060 вС 2) .Однако субстрат, получаемый таким способом, обладает узким прямолинейным интервалом зависимости оптичес" кой плотности от глубины превраще ния. Это сужает пределы определения ферментативной активности целлюлазных комплексов, что является недостатком качества получаемого продук" та. Кроме того, карбоксиметилцеллю" лоза, окрашенная ремазолом ярко-чер" ным .В, образует в воде желеобраэные суспенэии, что приводит к искажению результатов определения активности. Еще один недостаток известного спо" соба в том, что он трудоемок, Это связано с необходимостью частичной деполяризации исходной карбоксиметилцеллюлозы с помощью целлюлаэного комплекса с целью улучшения растворимости субстрата. 60Кроме тогомногократное осаждение . Окрашенного продукта большим количестном этанола удаления не связанного коналентно красителя снижает выход субстрата, 65 Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта,повышение его выхода и упрощениепроцесса,Поставленная цель достигаетсяпредлагаемым способом получения окрашенного субстрата для определенияцеллюлазной активности, предусматривающим окрашивание карбоксиметилцвллюлозы актинным краситеЛем с после"ду ющим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, причем окрашинание осуществляют красителем активным яркооранжевым ЖТ, взятым в количестне20-200 от массы карбоксиметилцеллюлозы, а отделение неснязанного красителя осущестнляют с помощью диафильтрации,Окрашивание обычно осуществляютпр 30-60 ОС.Способ осущестнляется следующимобразом.Связынание красителя с карбоксиметилцеллюлозой проводят в течение1-2 ч при 30-60 С.Диафильтрацию проводят до получения оптической плот"ности диафильтрата при длине волны490 нм не более 0,8 (для удаленияковалентно несвязанного красителяи солей из раствора окрашенного субстрата) с последующим осажцением полученного.продукта этанолом. При,диафильтрации раствор окрашенногосубстрата концентрируют, затем разбавляют концентрат дистиллированной,водой до первоначального объема иопять подвергают диафильтрации. Таким образом, проводят несколько циклов диафильтрации окрашенного субст-.рата, пока не достигнут оптическойплотности.диаФильтрата при длиневолны 490 нм не более 0,8, Установлено, что процесс диафильтрации окрашенного раствора карбоксиметилцеллюлозы подчиняется экспоненциальнойфункции. Для расчета необходимогоколичества воды для диализа пользуются следующей формулой:ч:-а,вьч, еп сс,где Ч - необходимый объем воды длядиализа окрашенного растнора карбоксиметилцеллюлозы 1Ч - исходный объем окрашенногоораствора карбоксиметилцеллюлозы после первоначального концентрирования;С " оптическАя плотность фильт"рата после диафильтрацииСо - оптическая плотность (0490)исходного раствора окрашенной карбоксиметилцеллюлоэы.Пользуясь формулой (1), заранее определяют необходимый для диализа объем воды (при достижении н конечном диафипьтрате .1)490 не более 0,8) .1056055 Способ получения субстрата Растворимость субстрата, мин Выход субстрата,Интервал прямолинейной зависимости оптическойплотности от глу"бины превращениясубстрата По примеру 1 По примеру 2 20 О - О,8 90 0 - 0,9 55 0 - 0,5 Известный П р и м е р 1. 10 г карбоксиметилцвллюлозы растворяют в 1000 мл воды, перемешивая, приливают 1000 мл 0,2-ного раствора красителя активного ярко-оранжевого ЖТ, В течение 60 мин небольшими порциями добавляют 20 г йб 50(, после чего приливают 100 мл 10-ного раствора ЙпзРО и перемешивают еще 60 мин. Все операции проводят при 30 еС. Полученный раствор охлаждают до комнатной темпера-, 10 туры и концентрируют диафильтрацией до конечного объема 0,5 л. Далее в диафильтрате определяют Оз 44. Согласно Формуле (1), объем воды для диализа составляет 15 Чд 2,84.0,5 1 п 44-=5,7 л.08После завершения процесса диафильтрации полученный концентрат (500 мл) осаждают 1000 мл зтанола в присутствии 0,01 М ЕС 1, Выпавший осадок окрашенной карбоксимвтилцеллюло.Вы отделяют центрифугированием, промывают этанолом, эфиром и высушива" ют в вакуум-эксикаторе. Получают 7 ф 5 г субстрата, имеющего вид оран" жевого порошка, хорошо растворимого и воде.П р и м е р 2. 20 г карбоксиметил- З 0 целлюлозы, растворяют в 1000 мл воды при 60 оС, приливают 1000 мл 4"ного Растворимость определяют следую" щим образом: 0,5 г субстрата заливают 50 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 5,0), смесь перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре и определяют время,. необходи" мое для полного растворения субстрата.Из таблицы видно, что раствори.мость предлагаемого и известного субстратов лежит в интервале 15-20 мин иэ чего следует, что упрощение технологии по предлагаемому способу не ухудшает растворимости субстрата, Выход субстрата по предлагаемому способу превышает его выход по известному ссособу на 20-35. 65 раствора активного ярко-оранжевого ЖТ, добавляют 40 г,Мс 250, 200 мл 10-ного раствора йю,РЮи перемешивают реакционную смесь 60 мин при 60 оС, Далеввыделение субстрата проводят аналогично примеру 1, Получают 18,0 г субстрата в виде ярко-оранже" вого пороШка.Определения целлюлазной активности.В две пробирки наливают по 1,0 мл 1-ного раствора субстрата (полученно" го по примеру 2) в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0. В одну пробирку .приливают .0,2 мл целлобронина Г 10 х с концентрацией 2,5 мг/мл, в другую,2 мл буФера (контроль) и инкубируют при 40 С в течение 10 мин, после чего в каждую пробирку добавляют по 5 мл осадителя, содержащего 80-ный монометнлоный эфир этиленгликоля, ацетатный буфер (0,3 М рН 5) и 0,4 ацетата цинка. Реакционную смвсывз балтывают, выдерживают 0,5 мин и цейтрифугнруют 5 мин, после чего определяю оптическую плотнссть супернатанта при длине волны490 нм против контрольной пробы. Оптическая плотность 0,410.Сравнительная оценка растворимости окрашенного субстрата, изготовленного по предлагаемому и известному ,способам дана в таблице. На чертеже показана зависимость оптической плотности от глубины превращения (времени инкубации) предлага" емого субстрата.Эту зависимость определяют по описанной методике,.используя целлюлазные комплексы Рапидазаи целло-. бронин Г 10 х по 0,04 ед, в каждой пробе (за единицу принимают активность такого количества фермента, которое расщепляет 1 мк моль гликозндных связей за 1. мин.) .Как видно из чертежа прямолинейный интервал зависимости оптической плотности от глубины превоащения субстрата О. - 0,9 обеспечивает широкие пределы определения активности целлюев айю аееавеФЕЗаказ 9292/36 Тираж 873 ПодписноеВПИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г.ужгород ул,Проектная, 4 лаз, что, в свою очередь, повышает точность определения. Таким образом, качество получаемого субстрата значи. тельно лучше, чем известного.Предлагаемюй способ получения окра-, шенного субстрата для определения " целлюпаэной активности упрощает технологию изготовления субстрата тем, что исключается предварительная обработка карбоксиметилцеллюлоэы целлю" лазным комплексом. При этом раство римость окрашенного субстрата, изго" товленного.по предлагаемому и известному способам, сходная.Диафильтрация,через полупроницаемые мембраны раствора окрашенной карбоксиметилцеллюлозы позволяет уда" дить ковалентно не связанные краси" фгель и соли и обеспечивает выход суб" страта 75-90% (по известному способу выход продукта составляет 50-60), Предлагаемый способ.диафильтрации позволяет исключить многократное переосаждение субстрата большими объемами этайола, тем самым упрощается технологический процесс подго-. товки субстрата и увеличивается без" опасность процесса.Предлагаемым способом получают субстраты, которые обеспечивают широкие пределы определения ферментативной активности комплексов, пос" кольку обладают прямолинейным интервалом зависимости оптической плотности от глубины превращения субстрата (О -0,9), тогда как такой интервал для субстрата, изготавливаемого по известному способу составляет 0 - 0,5,