Способ определения субпопуляции т-лимфоцитов

(51)4 0 ОСУДАРСТНЕИНЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ О ОБРЕТЕНИ И Мг яу у ОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ начено клин ич У 17еской имм чебных тических и л бластях меди ины. ости вышение точ вахт.Р.Ч злов ии .А ния субпопуляции пре Т-клеток. Для этого + 0,25 ч инкубируют ви в присутствии Т-а определяют прирост р Т-клеток (ауто-РОК). обусловлен дифференц предшественников аут зеткообразующие клет венном содержании и тимусзависимых лимфо приросту ауто-РОК за 979, ч. 122 ОПУЛЯЦ медициологичесвотных дн(71) Институт клинигии СО АМН СССР(56) 1 пшшпо 1 ояу Тп. 2, р. 686-691. 54). СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБП Т-ЛИИФОЦИТОВ 57) Изобретение относится к е, точнее к исследованию би их материалов человека и жииммунологическими методами,в научно-исследоват кои иммунологии льских, диагноцелях и в других ель изобретения пособа определедшественников в течение 6 + Т-лимфоциты кроктивина. Затем оэеткообраэующих Прирост ауто-РОК ировкой ранних о-РОК в аутороки. О количестредшественников цитов судят по 6 ч инкубации.Изобретение относится к медицине, а именно к исследованию биологических материалов человека и животных иммунологическими методами, и может быть использовано в клинической иммунологии и других областях медицины в научно-исследовательских, диагностических и лечебных целях.Целью изобретения является повыше , ние точности способа эа счет определения субпопуляции предшественниковТ-клеток.Способ осуществляется следующим ;образом. 15Была изучена динамика экспрессии , рецепторов к аутоэритроцитам в про; цессе 18"часовой инкубации лимфоцитов в присутствии Т-активина, Для этого выделяли МК периферической крови здо ровых доноров путем центрифугирования гепаринизированной венозной крови (5 мл, содержащей 500 ЕД гепарина) в градиенте плотности фиколлаверографина (3 мл, плотность 1,077) при 25 3000 об/мин. Выделение МК в концентрации 5 мл/мл инкубировали в пенициллиновых флаконах в среде РРМ 1-1640 (среда 199), дополненной 20%-ной инактивированной прогреванием сыворотки З 0человека 1 У группы в присутствии Тактивина (1 ЕД/мл) в течение 18 чпри 37 С. Количество ауто-РОК определяли после 1,5; 3; 6; 18 ч инкубации, исходя из заранее определенныхинтервалов времени, при которых определялись наиболее существенные изменения в количественном содержанииауто-РОК, Тест ауторозеткообразования проводили следущим образом:0,03 мл лимфоцитов (5 млн/мл) смешивали с равным объемом фетальной телячьей сыворотки, инкубировали смесь при 4 С в течение 30 мин и затем добавляли 0,03 мл 1 Ж-ной взвеси аутологичных эритроцитов. Далее клеточнуюсмесь центрифугировали 5 мин при1000 об/мин и инкубировали в течениеночи при 4 С, после чего производили подсчет ауто-РОК. Результаты вышеописанных экспериментов показывают, что содержание ауто-РОК в процессе 18-часовой инкубации с Т-активином существенно снижается. Однако снижению предшествует статистически значимый подъем, определяемый в 6-часовых культурах.В следующей серии экспериментов динамику экспрессии рецепторов к аутологичным эритроцитам в процессе 18-часовой инкубации с Т-активином исследовали в популяции лимфоцитов, обогащенных Е-розеткообразующими клетками (Т-лимфоцитами). Для этого 0,5 мл МК периферической крови (10 млн/мл) смешивали с О, 1 мл 20 Е- ной взвеси ЭБ в присутствии 153-ной инактивированной и адсорбированной ЭБ сыворотки доноров 1 Ч группы. Клеточную смесь инкубировали 15 мин при 37 С, центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин и вновь инкубировали в течение 1 ч при 4 С. Осадок осторожно ресуспендировали и центрифугировали в течение 20 мин при 1000 об/мин в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077), Находящиеся в осадке с Т-клетками эритроциты барана после удаления надосадочной жидкости лиэировали гипоосмолярным шоком. После этого оставшиеся Т-клетки троекратно отмывали средой 199 и доводипи до концентрации 5 млн/мл.Сепарирование Т-клетки инкубировали с Т-активином (1 ЕД/мл) в течение 18 ч при 37 С вышеуказанным способом. Процентное содержание ауто-РОК определяли сразу в популяции свежевыделенных Т-клеток и через 1,5, 3, 6, и 18 ч инкубации, Из результатов видно, что 18-часовая инкубация Т-клеток с Т-активином сопровождается значимым снижением содержания ауто- РОК беэ достоверно значимого 6-часового прироста, Сопоставляя результаты, можно предположить, что прирост ауто-РОК происходит за счет лимфоцитов, не содержащих Т-клеток, т.е. лишенных Е-рецепторов. Действительно, 18-часовая инкубация с Т-активином субпопуляции МК, лишенных Е-РОК (не Т-клетки) сопровождается приростом ауто-РОК, фиксируемым в интервале от 3 до 6 ч. Отсюда следует, что максимальный прирост ауто-РОК в этом случае наблюдается в 3-часовых культурах и составляет в среднем 5,9 + 2,77С целью выяснения, чем обусловлен прирост ауто-РОК в культурах МК-дифференцировкой незрелых предшественников ауто-РОК или реэкспрессией рецепторов на клетках, уже утративших данный маркер, исследовали динамику экспрессии рецепторов к ауто-эритроци - там в субпопуляции МК, лишенных ауто- РОК, Для удаления ауто-РОК из популяции МК 0,3 л МК (5 млн/мл) смешива1394138 Формула изобретенияСпособ определения субпопуляции Т лимфоцитов в периферической крови путем их инкубации в присутствии Т-активина с последующим определением прироста розеткообразующих Т-клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за счет определения субпопуляции предшественников Т-клеток, инкубацию проводят в течение 6 + 0,25 ч и определяют прирост ауторозеткообразующих клеток. Составитель П.БонарцевТехред М.Моргеитал Корректор О.Кундрик Редактор Г, Волкова Заказ 2215/41 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 475Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 ли с равным объемом фетальной телячьей сыворотки и инкубировали 30 мин при 4 С. К клеточной взвеси добавляли 0 3 мл 03-ной взвеси аутологичУ5 ных эритроцитов, обработанных предварительно нейроминидаэой. Для этого 103-ную взвесь троекратно отмытых в среде 199 аутологичных эритроцитов инкубировали в течение 45 мин при 37 С с нейроминидазой в разведении 1:2000. Далее клеточную смесь лимфоцитов фетальной телячьей сыворотки и обработанных нейроминидазой аутологичных эритроцитов центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин и помещали в водяную баню при 4 С на 2 ч, после чего осадок осторожно ресуспендиро" вали и центрифугировали в градиенте плотности фиколла - верографина (1,077) 20 в течение 10 мин при 4 С. Лимфоциты интерфазы, не содержащие ауто-РОК собирали пастеровской пипеткой и троекратно отмывали средой 199. Полученные таким образом лимфоциты инкуби ровали в течение 18 ч с Т-активином, определяя количество ауто-РОК в те же временные интервалы. Видно, что удаление ауто-РОК не отменяет увеличение содержания ауто-РОК. Фиксируемое в этом случае изменение времени прироста обусловлено изменением субпопуляционного состава инкубируемой смеси, являющегося следствием сепарации лимфоцитов.Таким образом, удаление клеток,35 уже экспрессирующих рецепторы к аутологичным эритроцитам, не сказывается на исследуемом приросте ауто-РОК.Чтобы окончательно убедиться в40 том, что прирост ауто-РОК обусловлен исключительно дифференцировкай ранних предшественников ауто-РОК в ауторозеткообразующие клетки, МК инкубировали в течение 6 ч с Т-активином.45 Затем удаляли все ауто-РОК и продолжали инкубацию оставшихся клеток с Т-активином в течение 18 ч. Предше ствующая элюминации ауто-РОК 6 - часовая инкубация МК с Т-активином преследовала цель стимулировать диффе ренцировку пре-ауто-РОК в ауто-РОК. В этом случае последующая инкубация оставшихся лимфоцитов с Т-активином не должна вызывать подъем содержания ауто-РОК. Следоват.льно, можно утверждать, что выявленный в процессе 6-часовой инкубации прирост ауто-РОК обусловлен дифференцировкой неэрельм (Е-негативных) предшественников ауто- РОК в ауторозеткообразующие клетви.П р и м е р. Мононуклеары периферической крови выделяют вышеописанным методом. Процентное содержание ауто-РОК определяют в непосредственно свежевыделенных МК и в культурах МК, инкубированных в течение 6 ч с Т-активином. Способы определения содержания ауто-РОК и инкубации лимфоцитов также описаны выше. О количественном содержании предшественников тимусзависимых лимфоцитов судят по приросту ауто-РОК за 6 ч инкубации.Приведенные результаты демонстрируют, что выявленный среди несепарированных МК прирост ауто-РОК статистически значим. Содержание незрелых тимусзависимых предшественников составляет около 6,53. Следовательно, налицо повышение точности предложенного метода по сравнению с известным методом (3,53).