Способ получения гриппозного антигенного нейраминидазного эритроцитарного диагностикума

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 1256748 61 К 39/00, 39/ Г" ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ТЕЛЬСТВУ А ВТОРСНОМ я специфичности, чуви стабильности диагно ью повышен вительно ции сме сенсибили т, отделяю посл центрифугируюнадосадочнуюнадосадочнойпервоначальн осадок иполученнойавляют 107,идкость, к идкости до о объема н вого неир Мают ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Одесский научно-исследовательский йнститут вирусологии и эпидемиологии им. И.И, Мечникова, Одесскоепредприятие по производству бактерийных препаратов и Московский научноисследовательский институт вакцин исывороток им. И,И. Мечникова(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИППОЗНОГО АНТИГЕННОГО НЕЙРАМИНИДАЗНОГОЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА путемсенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов нейраминидазным антигеном вируса гриппа ивыделением целевого продукта, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, с минидазного антигена и сенсибилизируют новую порцию бараньих эритроцитов, смесь центрифугируют, отделяют осадок и надосадочную жидкость,к полученной надосадочной жидкостидобавляют 207 первоначального объеманового нейраминидазного антигена исенсибилизируют еще одну новую порцию бараньих эритроцитов, далее всеполученные осадки объединяют, 12Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для приготовления гриппозного диагностикума.Целью изобретения является повышение специфичности, чувствительности и стабильности диагностикума за счет повторного использования нейраминидазного антигена и смеси трех порций сенсибилизированных им эритроцитов.Способ осуществляют следующим образом.50%-ную взвесь эритроцитов барана, формалинизированньж по Сздгшак 1, - , 1960, отмывают центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин 30-кратным объемом физиологического раствора рН 7,2-7,25 (раствор Р 1) и доводят до 2,5 .-ной концентрации раствором У 2 (1/15 М фосфатный буфер рН 7,2-7,25, содержащий 0,85 ЮаС 17". Отмытую 2,5 -ную взвесь формалинизированных эритроцитов смешивают с равным объемом раствора танина 1:20000, приготовленного на растворе В 2. Смесь выдерживают 10 мин при комнатной температуре (20 С), дважды отмывают 10-кратным объемом раствора Р 1, ресуспендируют до 2,5%-ной концентрации в 1/15 М фосфатном буфере рН 6,4-6,5, содержащем 0,85% ЙаС 1 (раствор В 3) и сенсибилизируют оптимальной дозой нейраминидазного антигена вируса гриппаДля выбора оптимальной сенсибилизирующей дозы нейраминидазного анти- гена в ряд пробирок с 5 мл 2,5%-ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов добавляют антиген в количестве 0,25-1,2 мл. После 20 ч контакта при 37 С к эритроцитам добавляют по 0,05 мл нейтрального формалина и через час контакта при тех же условиях сенсибилизированные эритроциты трижды отмывают 40-кратным объемом раствора В 4 (забуференный 0,85%-ный раствор йаС 1, рН 7,2-7,25 с нейтральным формалином в конечной концентрации 1 ). К осадку эритроцитов в каждую пробирку добавляют по 5 мл раствора 11 2 и по 0,05 мл нейтрального формалина, выдерживают 12 ч в термостате при 37 С и с полученными диагностикумами ставят реакцию.56748 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2Рабочей дозой нейраминидаэного антигена считают то его количество, при котором полученный диагностикум агглютинирует гомологичную сыворотку до наибольшего разведения при отсутствии реакции в контроле.Выбранную дозу нейраминидазного антигена вируса гриппа в перерасчете на соответствующий объем добавля. ют к 2,5 .-ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов, перемешивают в стеклянной емкости с резиновой пробкой и помещают в термостат при 37 С на 20 ч. Перемешивание производят каждые 2 ч.После этого взвесь эритроцитов центрифугируют при 2500 об/мин без добавления формалина. К полученной надосадочной жидкости добавляют 10% первоначального объема нейраминидазного антигена и при тех же условиях сенсибилизируют новую партию эритроцитов. Таким же образом надосадок используют в третий раз, добавляя к нему 20 первоначального объема нейраминидазного антигена.Осадки сенсибилизированных эритроцитов трижды отмывают 40-кратным объемом раствора У 4, доводят до 2,5 -ной концентрации раствором У 2, добавляют нейтральный формалин до 1 -ной концентрации и объединяют. Готовые диагностикумы выдерживают в термостате при 37 фС в течение 12 ч.П р и м е р. 5 мл 50 -ной взвеси эритроцитов барана, формалиниэированных по Сзкщав , трехкратно отмывают центрифугированием при 2500 об/мин в течение 1 О мин 150 мл раствора В 1.Для приготовления 2,5 -ной взвеси к 5 мл 50 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов до 100 мл раствора В 2, Полученную взвесь эритотроцитов смешивают с равным объемом раствора танина 1:20000. Танизация длится 1 О мин при комнатной температуре (20 С), Осаждение эритроцитов производят при том же режиме центриФугирования, после чего их трижды отмывают 300 мл раствора В 1.1 К осадку отмытых формалинизирован ных танизированных эритроцитов добавляют 100 мл раствора В 3 для получения 2,5 -ной взвеси; после чего производят сенсибипизацию эритроцитов нейраминидазным антигеном вируса гриппа, приготовленным твин-эфирным способом (разрушение вируса грипСоставитель М. ВасильевТехред И.Верес Корректор О. Луговая Редактор М. Циткина Заказ 4854/3 Тираж 660 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 3 1 па твиномв конечной концентрации 0,2 Х и половинным объемом эфира без подщелачивания и использование для осветления препарата обработки фреоном).Рабочая доза нейраминидазного антигена штамма вируса гриппа А/Техас 1/77 (активность в единицах .экстинции Е 0,700/0,1 мл) составила 0,5 мл антигена на 5 мл 2,57-ной взвеси эритроцитов или 1 О мл антигена на 100 мл 2,5 Х-ной взвеси формалинизированный тализироЪанных эритроцитов, Смесь антигена и 2,5 Х-ной взвеси эритроцитов помещают в термостат при 37 С на 20 ч, перемешивают каждые 2 ч. Через 20 ч контакта без добавления Формалина взвесь эритроцитов цеитрифугируют.Осадок сенсибилизированных эри" троцитов трижды отмывают 400 мл раствора У 4, ресуспендируют в 100 мл раствора У 2 и добавляют 1 мл нейтрального формалина. 256748 4Отделенным надосадком (100 мл),к которому добавляют 1 мл нейраминидазного антигена, ресуспендируют до 2,57-ной концентрации осадок свежей порции отмытых Формалиниэирован" ных танизированных эритроцитов, помещают в термостат при 37 С на 20 ч при постоянном помешивании, после чего осадок эритроцитов обрабатывают 10 как и в первом случае, а полученнымнадосадком И 00 мл)после добавления 2 мл нейраминидазного антигена суспендируют до 2,57-ной взвеси осадок третьей порции формалинизированных 15 танизированных эритроцитов и обраба"тывают аналогичным способом. Объециняют осадки и полученныйтаким образом диагностикум выдержи вают 12 ч при 37 С.Полученный диагностикум может использоваться в РНГА для диагностики гриппа и определения популяционного антинейраминидазного иммунитета,