Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител (его варианты)

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А Зс 51) А 61 К 39 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУд фф 4;"4.)411.ф,;, ,В. Эри Ме(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТЛРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ (ЕГО ВАРИАНТЫ) (57) 1, Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител путем ковалент. ного связывания гаптенной детерминанты с формалинизированными эритроцитами барана, о т .-, и ч а ю ц. и йс я тем, что, с целью выявления ан- тител к атропину,в качестве гаптенной детерминанты используют гемисукцинат атропина в концентрации,801079247 0,12-0,14 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:0,8- 3,0, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,12- 0,14 ммоль/мл при рН 5,8-6,0 и темпе ратуре 16-20 С в течение 12-15 ч.2. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител путем кпвалент. ного связывания гаптенной детерминан ты с формалинизированными эритроцитами барана, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью выявления антител к атропину, в качестве гаптенной детерминанты используют и-(антропин-азо)-бензойную кислоту в концентрации 0,01-0,12 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами взятыми в объемном соотноше. нии 1;5,4-13,5, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,08-0,1 ммоль/мл при рН 5,8- 6,0 и температуре 16-20 С в течение 12-18 ч.35 17 10792Диагностикумы, приготовление которых описано в примерах 7"11, 13 и 14, испытывали на сохранность при хранении без замораживания и при замораживании. Оказалось, что,эти 5Ф диагностикумы стабильны при 4 С в течение месяца и не теряли специфичной к атропину чувствительности. При замораживании в присутствии консерванта (53-ная инактивирован ная от комплемента кроличья сыворотка, абсорбированная нативными эритро цитами барана) в виде 5 Ф-ной суспензии с последующим оттаиванием перед использованием чувствительность 15 эритроцитарных диагностикумов не снижалась в течение 4-6 мес. Диагнос тикумы, получение кфторых описано в примерах 7-9 и 13, испытывали в реакции торможения гемагглютинации 20 (РТНГА) на специфичность выявления антител к атропину и к структурному аналогу атропина - тропацину, содержащему тропиновую группировку. Испытывали также специфичность диагности кума по выявлению влияния других холинолитиков, имеющих отдаленное химическое сходство с молекулой атропина (циклозил, трибутам), Оказалось, что диагностикум имеет высо- З 0 кую специфичность при выявлении антител к атропину, приче м хорошо выявляет антитела, специфичные к тропиновой части молекулы атропина. Другие холинолитики практически не тормозят РНГА между гаптенированным диагностикумом и специфичными к атропину сыворотками. Полученные результаты, представлены в табл.2.40Таким образом, эритроцитарный диагностикум с гаптенными детерминантами химически модифицированного . атропина.(п-(атропин-аэо)-бензойная кислота, ковалентно связанная с зрит 45 роцитами барана), приготовленный по предлагаемому методу, позволяет с высокой чувствительностью определять .в реакциях гемагглютинации анти тела к атропину (отдельные референс-сыворотки имели значение обратного титра к атропину 1280 и выше), определение антител специфично,что доказано торможением РНГА свободным антропином, В то же время, диагностикум избирательно выявляет антитела, специфичные к токсофорнойтропиновой части молекулы атропина,47 18что доказано способностью структурного и фармакологического аналога атропина - тропацина также тормозить РНГАоднако значительно хуже, чем атропин. Использование в качестве гаптенной детерминанты эритроцитарногодиагностикума - и-(атропин-азо)-бензойной кислоты не изменяет тропиновойчасти молекулы атропина и обеспечивает введение в его молекулу химической группировки, необходимой дляпоследующего ковалентного связывания модифицированного атропина соболочкой эритроцитов. Согласно изобретению ковалентное связывание модифицированного атропина с ооболочкой эритроцитов достигается путемиспользования инициаторов типа водорастворимых карбодиимидов, которыене входят в окончательный продуктреакции - гаптен-эритроцит барана,а следовательно, не оказывают влияния на специфичность эритроцитарного диагностикума в процессе распознавания с его помощью активногоцентра антител к атропину при ихвыявлениях в реакциях гемагглютинации; с другой стороны, присутствие,в и фтропин-азо)-бензойной кислоте,ковалентно связанной с Формалинизированными эритроцитами баранаииидной связью, молекулярной вставки между тропиновой частью и оболочкой эритроцитов удаляет эту детерминанту иммунохимической специфичности от эритроцитарной оболочки,что способствует выявлению в реакциях гемагглютинации антител, специфичных к токсофорной тропиновойчасти атропина с высокой чувствительностью. В итоге, изобретениемрешена задача создания эритроцитарного диагностикума, специфично определяющего в реакциях гемагглютина-ции антитела к атропину и избирательно к тропиновой группировке. Эритроцитарный диагностикум с гаптеннымидетерминантами химически модифицированного атропина может быть использован в лабораторной исследовательской практике для определения антительной продукции к антропину, исследования специфичности антител катропину, а также в клинической прак.тике для определения в простых и распространенных реакциях гемагглютинации антител к атропину у пациентов,поинимаюших атоопин,107924 УТаблица 11Чувствительность испецифичность эритроцитарных диагно-стикумов с гаптенной детерминантой остатка гемисукционата атропина при определении в референс-сывороткахспецифичных к.атропину антителА 19 йтр референс"сыворотки в РНГА и РТНГАе а тритроцитарный диагностикум, приготовленныйв условиях примера6 У 8 9 12 160 10 1 О 20 10 0 10 10 0 0 Референс- аыворотка 6401280640 - 320 - 320 + 801280 - 640 - 640 + 1601 г 8 о - 3 го - 6401280 - 5120 - 2560 - 5120 - 2560 - 1280 + 320 320 - 160 160 - 160 - 80 + 40 П р и м е ч а н и е: (+) - неспецифическая агглютинация в НКС1079247 ТаблицаЧувствительность и специфичность зритроцитарных диагностиикумов с гаптенной детерминантой остатка пи(атропинеаэо)ебеневойной кислоты при определении в референсесывороткахспецифичных к атропину антителА 1еееиеиеиЮе 4 е Титр референсесыворотки в РНГА и РТНГА 1 1 Эритроцитарный диагностикум, приготовленный в условиях примера 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Т - +ф+ 160 320 320 320 320 16040 20 10 10 10 1010 10 Ое 10 Ои 10 Ои 10 0 0 0 0 0 10 10+ + 80 80 40В количествоатропинасульфатав а 25.10 г,9где а ее еееие Референссыворотка для РНГА 640 1280 2560Сыво ротк аеаеееаеееев ееаевееев ввеююТороможеие РНГА атропин,а 2510 г где аееавееЮЮЮЮ 4 ее еР 10аваева е ююееююТитрв РНГА Торможение РНГА,атропинв РНГА, а"-г-"ф"1 Р то 20 640 20 10 ФО 0 0 2 20 ТО 0 320 20 10 160 Ь 20 0 0 б 10 10 О 80 40 10 О 0 6 10 0 20 8 1 0 32 Примеча В реакционнуюрастворы исс2 и 10"6 л зу для торможения вносилиемых веществ в объеме НИИПИ Заказ 1197/4 Тираж 688 Подписно юе ююю филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 479247 зПо второму варианту в качествегаптенной детерминанты используюти-(атропин-азо)-бензойную кислотув концентрации 0,01-0,012 ммоль/мли ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотнощении 1:5,4-13,5, осуществляютводным раствором карбодиимида в кон.центрации 0,08-0,1 ммль/мл при 0 РН 5,8-6,0 и температуре 16-20 Св течение 12-18 ч.Первый вариант выполнения способа.А. Получение Формалинизированных, 15 эритроцитов барана.1. Воздействуют 6 объемами 34 мас./ раствора Формальдегида вФосфатном буФерном растворе срН 7,2 на 1 объем 40-60 мас.3-нойсуспензии от белков сывороткиэритроцитов барана в течение 2-3 чпри 16-20 С, дополнительно воздействием 2-2,5 объемами 35-40 мас,Фного раствора Формальдегида в течео25 ние 20-24 ч при 4-62. Формалинизированные таким об разом эритроциты многократно отмывают в 50-100-кратном избытке Физиологического раствора с рН 6,8-7,4и ресуспензируют до концентрации40-60 мас.4 в Физиологическом растворе.Б. Синтез гемисукцината атропинасогласно Газ 16 ейа (8)по реакции б бн,-1 = о0Обн-(н-бн ОнСН - (,= О 6 Н 51О.он-ооо.он.Он,о-(о.(он,).Ооон В. Конъюгирование гемисукционатаатропина с Формалинизированнымиэритроцитами барана.45К одному объему 4 Чмас./ суспензии Формалинизированных эритроцитов барана п.1, на Физиологическомрастворе (0,15 И раствор йаС)при перемешивании добавляют 0,83;0 объема водного раствора гемисукцината атропина при концентрации0,1 " 0,12 ммоль/мл и рН 5,8 - 6,0(используют только свежеприготовленный раствор гемисукцината атропина,см п.Б),К смеси эритроцитов и гемисукцината атропина прикапывают .1,01 10Изобретение относится к иммунохимии и Фармакологии, преимущественно, к применению эритроцитарных диагностикумов, и может быть использовано для выявления в биологических средах антител к низкомолекулярным биологически активным соединениям.Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов с детерминантами различных антигенов и гаптенов, основанные на ковалентном связывании детерминанты с .эритроцитами Г 11.Однако известные способы получения эритроцитарных диагностикумов не позволяют получить диагностикум с гаптенной детерминантой атропина.Целью изобретения является выявление антител к атропину.Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения эритроцитарного диагностикума для выявления специФических антител по первому варианту в качестве гаптенной детерминанты используют гемисукционат атропина в концентрации 0,12- 0,14 ммоль/мл и ковалентное связывание ее с эритроцитами, взятыми в объемном соотношении 1:0,8-3,0, осуществляют водным раствором карбодиимида в концентрации 0,12- 0;14 ммоль/мл при рН 5,8-6,0 и темпе ратуре 16-20 С в течение 12-15 ч.-4,0 объема водного раствора водорастворимого карбодиимида при концентрации 0,12-0,14 ммоль/мл. Придобавлении раствора карбодиимидасмесь перемещивают и поддерживаютрН 5,8 - 6,0 с помощью 0,5 н.НС 1Реакционную смесь инкубируют в течение 12-15 ч при 16-20 С и рН 5,8-6,0 без перемешивания,Эритроцитарный осадок отмывает многократно Физиологическим раствором ФосФатного буФера, рН 7,0 - 7,4 с центриФугированием.Второй вариант выполнения спо- соба1079247 НООб и зО он-он 1 он Ооо 3А. Получение Формалинизированныхэритроцитов барана проводится также, как по первому варианту. нос о О нн "нй 3. Конъюгирование и-(атропйн азо)-бенэойной кислоты с Формалиниэированными эритроцитами барана.К одному объему 40-60 мас.Ф-нойсуспензии Формалинизированных эритроцитов барана (п.А) на Физиологическом растворе (0,15 М раствор йаС 1,при перемешивании добавляют 5,4-13,5объемов буферного раствора и-(атропин азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,91-0,012 ммоль/мл л(состав буфера : й,й-диметилформамид,0,1 М боратный буфер, соотношениеобъемов ингредиентов 1:1, рН 8,8 - З 09,0), рН реакционной смеси доводятдо 5,8 - 6,0, добавляя по каплямпри перемешивании 1 н.НС 1.К смеси эритроцитов барана ии-(атропин азо)-бенэойной кислоты З 5при перемешивании добавляют по каплям 07-1,75 объемов водного раство.ра водорастворимого карбодиимида сконцентрацией 0,08-0,1 ммоль/мл прирН 5,8-6,0. 40Смесь инкубируют при комнатнойтемпературе 16-20 С в течение 12 о-18 ч, рН 5,8-6,2,Эритроцитарный осадок отмываютмногократно в избытке Физиологического раствора Фосфатного буфера,рН 7,2-7,Ч) с центрифугированием.Способ по первому варианту поясняется следующими примерами.П р и м е р 1. Синтез гемисукци.ната атропина. 150 мг атропина основания растворили в 2 мл сухогохлороформа при комнатной температуре. К раствору добавили 115 мг янтар-,ного ангидрида и смесь перемешивали 55в течение 2 ч на магнитной мешалке.Затем хлороформ удалили Фильтрациейи выпариванием осадка в вакууме. 4Б. Синтез и-(атропин азо)-бензойной кислоты, Согласно Чцггбцг 9 ег ей.а 1. по реакции. нооо О ю =и -еР Оставшуюся маслянистую жидкость растворили в 3 мл дистиллированной водыи установили рН 5,8, прибавляя2 н,йаОН.П р и м е р 2. Синтез гемисук.цината атропина вели в условияхпримера 1, только раствор гемисукцината атропина имел рН 6,0.Установка рН 5,8 - 6,0 являетсянеобходимым условием получения высокочувствительного эритроцитарногодиагностикума. При несоблюдении этогоусловия диагностикум имел чувствительность выявления в реакциях агглю.тинации антител к атропину ниже в4 - 8 раз,Далее гемисукцинат атропина дляконъюгирования с эритроцитами готовили как в примере 1.П р и м е р 3. Получение Формалинизированных эритроцитов барана,Эритроциты барана отмывали забуференным Физиологическим раствором при центрифугировании, отделяли эритроцитарный осадок, готовили 60-ную эритроцитарную суспензжю на физиологическом растворе фосфатного буфера. К одному объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 объемов 3-ного раствора Формальдегида в фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Смесь инкубировали в течение 3 ч и затем дополнительно прибавляли к смеси 2 объема 401-ного раствора Формальдегида и инкубировали смесьопри 4 С в течение 20 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в 100-кратном избытке Физиологического раствора Фосфатного буфера при центрифугировании, рН 7,4 и ресуспензировали до концентрации 50 мас.ФВ 10792в Физиологическом растворе Фосфатного буфера с рН 7,2,П р и м е р 4. Эритроциты баранаотмывали забуференным физиологическим раствором, отделяли осадок эритроцитов, готовили 40 мас.3-ную эритроцитарную суспензию на Физиологическом растворе Фосфатного буфера.К одному объему эритроцитарной суспензии добавляли 6 объемов М-ного 10раствора формальдегида в ФосфатномбуФерном растворе с рН 7,2. Смесьийкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и затем дополнительно прибавляли к смеси 2,5 объема35-ного раствора формалина и инкубировали смесь при 6 С в течение24 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в 50-кратном избытке физиологического растворафосфатного буфера ори центрифугировании, рН 7,0 и ресуспензировалидо концентрации 403 в Физиологическом растворе Фосфатного буфера,рН 7,2. 25П р и м е р 5. Эритроциты баранаФормалинизировали в условиях примеоа 3, только полученный эритроцитарный осадок отмывали 10-кратно в 50 кратном избытке Физиологическогораствора Фосфатного буфера с рН 6,8и ресуспензировали до концентрации60 в Физиологическом растворе ФосФатного буфера с рН 7,2.Варьирование в условиях Формалинизирования эритроцитов (примеры353-5) не оказывало существенного влияния на чувствительность и сохранность эритроцитарных диагностикумов,которые били приготовлены на основеэтих эритроцитов.П р и м е р 6, Конъюгированиегемисукцината атропина с Формалинизированными эритроцитами барана спомощью водорастворимого карбодиимида Й-циклогексил"й-Д(Й-метилморфолиино)-этил 1.карбодиимид-п-толуолсульфоната.0,15 ммоль гемисукцината атропинарастворяли в 0,75 мл дистиллированнойводы, устанавливали рН 5,8, прибав-,ляя по каплям 2,0 н.йаОН, и при перемешивании полученный раствор добавляли к 0,5 мл 50-ной суспензии Фор-.малинизированных эритроцитов баранана физиологическом растворе, К смесигемисукционата атропина и Формалинизированных эритроцитов по каплямприкапывали раствор 0,14 ммоль й-цик 47 ьлогексил-Й-(й-метилморфолиино)-этил карбодиимид-и-толуол сульфоната вмл дистиллированной воды, при этом смесь перемешивали и поддерживали рН 5,8 добавлением в реакционную смесь 0,5 н,НС 1, Затем реакционную смесь инкубировали при комнатной тем. пературе в течение 12 ч без перемешивания, Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали восьмикратно 50-кратным избытком Физиологического раствора Фосфатного буфера срН 7,2.П р и м е р 7, 0,31 ммоль гемисукцината атропина растворяли в 1,5 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 6,0, прибавляя по каплям 2,0 н.йаОН, и при перемешивании полученный раствор добавляли к 0,5 мл 603-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на Физиологи ческом растворе, 0,28 ммоль й-циклогексил-й-р(й-метилморфолиино)-этил 3 карбодиимид-и-толуол сульфоната раст воряли в 2,0 мл дистиллированной воды и по каплям добавляли к смеси гемисукцината атропина и Формалинизированных эритроцитов барана, перемешивая смесь и поддерживая рН 6,0 добавлением 0,5 н.НС 1Затем реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 15 ч, Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали пятикратно 100-кратным избытком физиологического раствора фосфатного буфера, рН 7,2. П р и м е р 8. 0,075 ммоль гемисукцината атропина растворяли в 0,35 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 5,8, добавляя в раствор по каплям 2 н,йаОН, и при перемешивании полученный раствор прибавляли к 0,5 мл 403-ной суспензии Формали-, низированных эритроцитов барана" на Физиологическом растворе К смеси гемисукцината атропина и эритроцитов по каплям при перемешивании добавляли 0,07 ммоль й-циклогексил-й-(Й- -метилморфолиино)"этил 1 карбодиимид- -п-толуол сульфоната в 0,5 мл дистиллированной воды, при этом рН 5,8 реакционноч смеси поддерживали добавлением 0,5 н.НС 1. После этого реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 12 ч. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали семикратно 50-кратным избытком Физи79217 7 10 ологического раствора фосйатного буфера, рН 7,2.П р и м е р 9. Получение эритроцитарного диагностикума проводили в условиях примера 6, только к смеси гемисукцината атропина и Формалинизированных эритроцитов прибавляли раст вор 0,11 ммоль солянокислого 1-этил -3-(3-диметиламинопропил) карбодиими да в 1 мл дистиллированной воды. Далее синтез эритроцитарного диагностикума вели в условиях примера 6.П р и м е р 10. Получение эритро. цитарного диагностикума проводили в условиях примера 8, только к смеси гемисукционата атропина и Формалинизированных эритроцитов прибавляли 0,08 ммоль солянокислого 1-этил- -(3-диметиламинопропил) карбодиимида в 0,5 мл дистиллированной воды, при этом рН 6 реакционной смеси поддерживали прибавлением по каплям 0,5 н.раствора НС 1. Далее синтез эритроцитарного диагностикума проводили в условиях примера 8.П р и м е р 11.0,62 ммоль гемисукцината атропина растворяли в 3 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 5,8, прибавляя по каплям 2,0 н.МаОН, и при перемешивании полученный раствор добавляли к 0,5 мл 503-ной суспензии формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе.0,56 ммоль М-циклогексил-М-,р(Ч-метилморфолиино)-этил 1 карбодиимид-п-толуол сульфоната растворяли в 1,0 мл дистиллированной воды и ,по каплям добавляли к смеси гемисукцината атропина и Формалинизированных эритроцитов барана, перемешивая смесь и под.держивая рН 5,8 прибавлением по каплям 0,5 н.НС 1, Затем реакционную смесь инкубировали без перемешивания в течение 12 ч. Осадок сенсибилизированных эритроцитов отмывали пятикратно 100-кратным избытком физиологического раствора Фосфатного буфера, рН 7,2.П р и м е р 12. О,ОЙ ммоль гемисукцината атропина растворяли в 0,2 мл дистиллированной воды, устанавливали рН 5,8 и при перемешивании этот раствор прибавляли к 0,5 мл 504-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе. Далее к смеси гемисукцината атропина и эритроцитов добавляли при перемешивании 0,035 ммольМ-циклогексил-Ч (М-метилморфоли-,ино)-этила карбодиимид-и-толуолсульфоната в 0,3 мл дистиллированной 5 воды, рН реакционной смеси 5,8. Затем реакционную смесь инкубировалипри комнатной температуре без перемешивания в течение 12 ч, Эритроцитарный осадок отмывали пятикратнов 100-кратном избытке Физиологического раствора Фосфатного буфера,рН 7,2.П р и м е о ы 13-15. Подготовкаэритроцитарного диагностикума к ис,пользованию в РНГА (реакция непрямойагглютинации) или к длительному сохранению.Эритроцитарные диагностикумы,получение которых описано в приме рах 6-12, после отмывки Физиологическим раствором фосфатного буфераресуспензировали до концентрации1 Ф в 11-ной прогретой кроличьей сыворотке, адсорбированной нативными 25 эритроцитами барана (+56 С, 30 мин),в 1-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, 13-ного раство-ра полиглюкина, которые готовилина Физиологическом растворе ФосЗ 0, Фатного буфера, РН 7,2. Эритроцитарные диагностикумы готовили длядлительного хранения путем быстрогозамораживания 53-ной суспензии сенсибилизированных эритроцитов в 3553-ной инактивированной от комплемента и адсорбированной эритроцитами барана кроличьей сыворотке в сме.си сухбго льда и ацетона (ампулы сдиагностикумом предварительно запа ивали) и сохраняли до использованияопри -30 С. Дальнейшее испытание диагностикумов не выявило преимуществни одного из использованных растворов высокомолекулярных соединений, 45 поэтому в своднои таблв 1 представлены результаты определения в РНГАспецифичных к атропину антител, которые были получены с диагностику"мами, полученными согласно примеров6-12, в виде 13-ной суспензии на.13-ной кроличьей сыворотке.П р и м е р 16. Испытание эри 1 троцитарных диагностикумов,приго,товленных в условиях примеров 6-12 55в РНГА со специфичными к атропинуреференс (тест) - сыворотками.Эритроцитарные диагностикумы,получение которых описано в примерах6-12, тестиродали в РНГА со специ"927 30 35 40 50 55 9 107 фичными к атропину донорскими тест- сыворотками, которые получали от экспериментальных животных при иммунизации последних искусственными. конъюгированными антигенами с атропИном в качестве гаптена. На основа нии результатов определения чувстви. тельности приготовленных диагностикумов по выявлению специфичных к атропину антител в тест-сыворотках делали вывод обэффективности процедуры их синтеза (примеры 6-12). Реакцию непрямой гемагглютинации ставили в модификации по микрометоду по стандартной методике. Полученные результаты представлены в . таблАнализ полученных результатов позволил заключить,что наивысшей чув ствительностью при определении специфичных к атропину антител в РНГА обладают эритроцитарные диагностику" мы, которые приготовлены в условиях примеров 6-11, однако диагностикум, приготовленный согласно условиям примера 11,неспецифически агглютинировал в присутствии неимунной (контрольной) кроличьей сыворотки, что делает невозможным его помощью определение специфичных антител, Таким образом, условия примеров 6-10 явля ются оптимальными при синтезе эритроцитарных диагностикумов с гаптенной детерминантой - химически модифицированным атропином.П р и м е р 17, Испытание зритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условиях примеров 6"10, после длительного хранения в виде консервайта. Эритроцитарные диагностикумы, полученные в условиях примеров 6-10, хранили до 6 мес в замороженном сос тоянии в виде 5 ной суспензии на 53-ной инактивированной от комплемента прогреванием кроличьей сыворотке, предварительно адсорбирован" ной нативными эритроцитами. барана. Показали, что сенсибилизированные эритроциты до 4 мес. сохраняют специфичную чувствительность при определении в РНГА антител к атропину. После оттаивания их Физико-химические свойства и чувствительность практически не меняются.П р и и е р 18. Испытание чувствительности определения в РНГА специфичных к атропину антител,5 ФО 15 20 25 10Для доказательства специфичностиопределения в РЙГА антител к атропинус помощью эритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условияхпримеров 6-10, с этими диагностикумами и тест сыворотками ставилиреакцию торможения непрямой гемагглю.тинации атропином. РНГА тормозилиатропином в концентрации 0,5-5,0 мг//мл. Примеры некоторых экспериментов с соответствующими результатамисведены в табл,2. Таким образом,РНГА между эритроцитами с гаптеннойдетерминантой - химически модифицированным атропином и специфичными катропину антителами тормозится атро"пином, добавляемым в реакционную Фазучто свидетельствует о специфичностиэритроцитарного диагностикума по отношению к выявлению с его помощьюантител к атропину,Как видно из примеров конкрет"ного выполнения .и данных таблиц, предлагаемый способ решает создание эритроцитарного диагностикума,. специфич, но определяющего в, РНГА антитела к атропину. Эритроцитарный диагностикумс гаптенной детерминантой - химически модифицированным атропином (гемисукцинат атропина, ковалентно связан-.ный с эритроцитдрной оболочкой имиЯной связью), приготовленный попредлагаемому методу, позволяет свысокой чувствительностью определятьв реакциях гемагглютинации антителак атропину (отдельные референс-сывоворотки.имели значение обратного титра к атропину 2560 и выше), определение антител специфично, чтодоказано торможением РНГА свободныматропином, Использование в качествегаптенной детерминанты эритроцитарного диагностикума гемисукцинатаатропина позволило сохранить обе детерминанты антигенной специфичности атропина: тропиновую часть и ароматическое кольцо - удаляет их от обо .лочки эритроцитов; что способствует выявлению с помощью такого диагностикума всей популяции антител,высоко специфичных к атропину. Этойже цели служит и использование в качестве агентов, формирующих ковалент.ное связывание, гептенной детерми"нанты - химически модифицированногоатропина, водорастворимых карбодиими;дов, соединений лишь активирующихФормирование имидной связи, но невходящих в окончательный продукт12 н 006 С) мн - -ЕООб О) Б = - уИОИОНб 1бР 5 11 107924 реакции - эритроцитарный диагностикум а следовательно, не влияющих на специфичность последнего при распознавании с его помощью антител к атропину в РНГА. Эритроцитарный 5 диагностикум, приготовленный в условиях примеров 6-10, 13-15 не теряет специфичной чувствительности при хранении 4-6 С в течение 2 мес. безоконсерванта, а в присутствии консер-, 10 и-Аминобензойную кислоту 10,3 мг(0,075 ммоль) растворяли в 1,5 мл0,25-0,2 М НС 1 и раствор охлаждалидо 4-6 С на ледяной бане, К этомураствору по каплям при перемешива-,нии на ледяной бане добавляли охлаж- зоденный водный раствор нитрита натрия(69 мг в 0,6 мл воды). Реакционную,смесь инкубировали в течение 1 чпри перемешивании на ледяной бане.После окончания срока инкубации вреакционной смеси добавляли0,025 ммоль сульфаминовой кислоты(2,5 мг в 0,3 мл охлажденной воды),58 мг атропина сульфата (0,1 ммоль)растворяли М М-диметилформамидном -боратном буфере; соотношение М 1 М-диметилформамид, 0,1 М боратный буфер == 1:1, рН 9,0. Раствор охлаждалидо 4-6 С и при перемешивании кэтому раствору прибавляли весьобъем полученной реакционной смеси.Реакционную смесь инкубировали в темоноте в течение 4 ч при 4-6 С, перемешивая, после чего рН реакционнойсмеси доводили до 5,8, добавляя покаплям 1,0 н.НС 1.П р и м е р 2. и-(Атропин-азо)-бензойную кислоту получали в условиях примера 1, только после окончания срока инкубации реакционной смеси рН доводили до 6,0, добавляя1 нНС 1,П р и м е р 3. Получение Формалинизированных эритроцитов барана. ванта при замораживании и хранении при (-30) - (-40 оС) - в течение 4-6 мес.Способ по второму варианту поясняется следующими примерами.П р и м е р 1. Синтез и-(атропин азо)-бензойной кислоты (химически. кая модификация атропина азосочетанием с и-аминобензойной кислотой) по реакции Эритроциты барана отмывали забуференным Физиологическим раствором при центрифугировании, отделяли эритроцитарный осадок, готовили 50 мас.Ф-ную суспензию эритроцитов на Физиологическом растворе Фосфатного буфера. К одному объему эритро" цитарной суспензии добавляли 6 объемов 3 мас,3-ного раствора формальдегида в Фосфатном буферном растворе с рН 7,2. Смесь инкубировали в течение 3 ч и затем дополнительно прибавляли к смеси 2 объема 40 мас.ь-но го раствора Формальдегида и инкубировали смесь при 4 С в течение 20 ч,Полученный эритроцитарный оса". док 8 раз отмывали в 100-кратном избытке Физиологического раствора Фосфатного буфера при центрифугиро" вании, рН 7,4 и ресуспензировали до концентрации 50 мас.3 в физиологическом .растворе Фосфатного буфе" ра, рН 7,2.П р и м е р 4. Эритроциты барана формалинизировали в условиях примера 3, только для Формалинизирования готовили 60 масД-ную суспензиюэритроцитов барана.П р и м е р 5. Эритроциты барана отмывали забуференным Физиологическим Раствором, отделяли осадок эритроцитов, готовили 40 мас.-ную зритроцитарную суспензию на физиологическом растворе Фосфатного буфера. К однойу объему эритроцитарной суспензии до1079247 15 20 30 13бавляли 6 объемов 4 мас.Ф-ного раствора формальдегида в Фосфатном буФерном растворе, рН 7,2. Смесь инку.бировали в течение 2 ч прикомнатной температуре и затем дополнительно прибавляли к смеси 2,5 объема35 мас,Ф"ного раствора Формалина иинкубировали смесь при +6"С в течение 24 ч. Полученный эритроцитарный осадок 8 раз отмывали в50-кратном избытке Физиологическогораствора Фосфатного буфера при центрифугироваиии, рН 7,0, и ресуспен,зировали до концентрации 40 мас.3в физиологическом растворе фосфатного буфера,рН 7,2. Варьированиев условиях Формалинизирования эритроцитов (примеры 3-5) не оказывало существенного влияния на чувствительность и сохранность эритроцитарных диагностикумов, приго- "товленных на основе этих эритроцитов.П р и м е р 6. Конъюгированиел(атропин азо)-бензойной кислоты сФормалиниэированными эритроцитамибарана в присутствии инициатора типа водорастворимых карбодиимидов-М-циклогексил-М-р(М-мйилморфоли-,ино)-этил 3 карбодиимид-п-толуолсульфоната.К 0,5 мп 403-ной суспензии Формалиниэированных эритроцитов барана .на Физиологическом растворе при перемешивании добавляли 13,5 мл буферного раствора и-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией001 ммоль/мл, а затем по каплям1,75 мл водного раствора М-циклогексил-М-р(М-метилморфолиино)-этил 40карбодиимид-и-толуол сульфоната сконцентрацией 0,08 ммоль/мл, Смесьинкубировали при 16 С в течение012 ч, рН 5,8. Осадок инкубированныхэритроцитов многократно отмывалив 100-кратном избытке физиологического раствора Фосфатного буфера(0,15 М МаС 1, 0,075 И Фосфатов,рН 7,2),П р и м е р 7. К 0,5 мл 504-нойсуспензии Формалинизированн х эритроцитов барана на Физиологическом растворе при перемешивании добавляли6,75 мл буферного раствора и-(атропин-аэо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/мл, а затем по кап.лям 0,87 мл водного раствора М-циклогексил-М-(5 (М-метилморфолиино)-атил карбодиимид-и-толуол сульфоната с концентрацией 0,08 ммоль/мл, Лалее синтез продолжали в условиях примера б.П р и м е р 8. К 0,5 мл 503-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на физиологическом растворе при перемешивании добавляли 4,0 мл буферного раствора и-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/мл, а затем по каплям 052 мл водного раствора Ч-цикло гексил-М-ГР(Ч-метилморфолиино)-этил 1 карбодиимид-и-толуол сульфоната сконцентрацией 0,08 ммоль/мл, Смесьоинкубировали при 16 С без перемешивания в течение 12 ч, рН 5,8. Осадок инкубированных эритроцитов много кратно отмывали в 50-кратном избытке Физиологического раствора Фосфатного буфера.П р и м е р 9 К 0,5 мл 40-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на Физиологическом растворе при перемешивании добавляли 4,0 мл буферного раствора и-(атропин-азо)-бензойной кислоты с концентрацией 0,12 ммоль/мл, а затем по каплям 0,52 мл водного раствора М-циклогексил-И-(М-метилморйолиино)-этил 1 карбодиимид-и-толуол сульфоната с концентрацией 0, 1 ммоль /мл, Смесь инкубировали при 20 С. без перемешивания в течение 16 ч, рН 6,0, Осадок инкубированных эритроцитов многократно отмцвали в 100- кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера при центрифугировании.Коньвгирование и-(атропин-аэо)- -бензойной кислоты с формалинизированными эритроцитами барана в присутствии инициатора типа водорастворимых карбодиимидов - солянокислого 1-этил-(3-диметиламинопропил) карбодиимида.П р и м е р 13. К 0,5 мл 50/-ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на Физиологическом растворе Фосфатного буфера при перемешивании добавляли 4,0 мл буферного раствора и-(атропин-азо) -бензойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/ /мл, а затем по каплям 0,52 мл водно. го раствора солянокислого 1-этил- -(3-диметиламинопропил) карбодиимида с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесьеинкубировали при 20 С без перемешива.15 10 ния в течение 16 ч, рН 5,8. Осадок инкубированных эритроцитов многократ но отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора фосфатного буфера.П р и м е р 14. К 0,5 мл 503- ной суспензии Формалинизированных эритроцитов барана на Физиологическом растворе фосфатного буфера при перемешивании добавляли 2,7 мл буферного раствора и-(атропин-азо)-бен зойной кислоты с концентрацией 0,01 ммоль/мл, а затем по каплям 0,35 мл водного раствора солянокислого 1-этил-(3-диметиламинопоопил) карбодиимида с концентрацией 0,08 ммоль/мл. Смесь инкубироваоли при 18 С без перемешивания в течение 18 ч, рН 6,0. Осадок инкубированных эритроцитов многократно отмывали в 100-кратном избытке физиологического раствора Фосфатного буфера.Эритроцитарные диагностикумы, получение которых описано в примерах 6-14, в реакциях гемагглютинации использовали в виде 1,3,5-ных суспензий. Суспензии готовили на 1 3- ной прогретой при 56 С в течение 30 мин и абсорбированной нативными эритроцитами барана нормальной (неимунной ) кроличьей сыворотке, 1-ном растворе человеческого или бычьего сывороточного альбумина, на 1/-ном растворе полиглюкина, которые, в свою очередь, готовили на Физиологическом растворе Фосфатного буфера, рН 7,4. Эритроцитарные диагностикумы для длительного хранения получали путем быстрого замораживания 54-ной суспензии гаптенированных эритроци- тов на 5/-ной инактивированной от комплемента прогреванием и абсорбированной нативными эритроцитами барана нормальной кроличьей сыворотке в смеси сухого льда и ацетона (диагностикум предварительно ампулировался). Замороженный диагностикум хранили при (-30) - (-40) С, Существенных различий в.чувствительности диагностикумов, приготовленных на 13-ной сыворотке, 14-ных растворах альбумина, 1l-ном растворе полиглюкина, не выявили. Чувствитель ность при определении специфичных к атропину антител зависела от соот ношения ингредиентов реакции на ста дии коньюгирования и-(атропин азо)- -бензойной кислоты с эритроцитами.79247 16 40Из представленных данных видно,что эритроцитарные диагностикумыс гаптенными детерминантами и-(атропин-азо)-бензойной кислоты, приготов45ленные в условиях примеров 7-11Ф13 и 14, пригодны для выявления вРНГА специфичных к атропину антител. Оптимальными условиями получения диагностикума являются условия50,примеров 7-9 и 13, диагностикумы, по.лученные в этих условиях, имеют на-ибольшую чувствительность. Диагностикум, полученный в условиях примераб, непригоден из-за его неспециФической агглютинации в присутствиинормальной кроличьей сыворотки,Диагностикум, полученный в условияхпримера 12,малопригоден из-за егонизкой чувствительности. 5 1 О 15 20 25 30 35 Наибольшую чувствительность имели диагностикумы в виде 1-ной суспензии гаптенированных эритроцитов, по. этому в табл.1 представлены результаты, полученные при тестировании эритроцитарных диагностикумов, приготовленных в условиях примеров 6-14 при условии, что испытовались гаптенированные диагностикумы в виде 13-ной суспензии на 1 Ф-ной нормальной кроличьей сыворотке.Эритроцитарные диагностикумы, получение которых олисано в примерах 6-14, тестировали в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) на чувствительность выявления антител к атропину. Для определения чувствительности диагностикумов по вь 1 явлению специфичных к атропину антител использовайиб референс (тест)-сыворотки от животных доноров, кото. рых иммунизировали белковыми антиге нами с гаптенной детерминантой атропина. Референс-сыворотки получали по общепринятой методике, инактивировали комплемент прогреванием и абсорбировали нативными эритроцитами барана. РНГА ставили в модификации по микрометоду на планшетах микротитратора "Такачи" общепринятым способом. В качестве контрольной использовали нормальную кроличью сыворотку - тест на неспецифичную аг. глютинацию диагностикумов в присутствии сывороточных белков. Реэульта" ты оценки и чувствительности зрит" роцитарных диагностикумов по выявлению в РНГА специфичных к атропину антител сведены в табл.3.