Способ определения коэффициентов задержания микрофильтрационных мембран

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН П 13/О 1) 4 С 12 Я 1/00 ИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕНИ БЪАИОИКА 94/28-14.86.Бюл. Уюзный научнститут ос исследовачистых би олоцкий, Н.А,Н,Черка Михайлов 6(088.8) ское свидет кл. С 12льство СС1/00,ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТОВ ЗАДЕРЖАНИЯ МИКРОФИЛЬТРАЦИОННБ 1 Х МЕМБРАН путем пропускания черезмембраны калибровочного раствора,содержащего белки, анализа фильтрата и концентрата методом гель-хроматографии, вычисления коэффициентовзадержания, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повьппения точности определения, в калибровочный раствор дополнительно вводят биологические частицы в концентрации 2 хх 10 - 4 х 10" 1/см12474Изобретение относится к физической химии, а именно к процессам мем-,бранного разделения биологическихсуспензий калибровки микрофильтрационных мембран, 5Цель изобретения - повышение точности определения коэффициентов за-,держания микрофильтрационных мембран - достигается эа счет болееточного моделирования реальных про Оцессов разделения биологических суспензий в результате добавления в калибровочный раствор биологических8частиц в концентрации 2 10 -4 х,х 10 1/смэ, 15Калибровочный раствор, содержа-,щий смесь белков и амикокислоти/илипептидов сММ 200 в 2400 дальтон, вконцентрациях 0,05-6,7 мг/мл и биологические частицы (вирусы, бактерии и т.,ц.) в концентрации 2 1 О4 10" 1/см , фильтруют через мембрану (ацетилцеллюлозкые мембраны типа Биопор, полиамидные, ядерные лавсановые Фильтры) .В начальный период процесса ипосле концентрации (К) отбирают пробы Фильтрата и концентрата (по 0,4 млкаждого) и анализируют концентрацииих компонентов гель-хроматограФией ЗОна колонке, наполненной ультрагелемАсА, при скорости элюции 3,5 -4 см"/ч. После этого по площадям(высотам) соответствующих гель-хроматографических пиков находят коэф 1фициент задержания согласно ФормулеЧ=.С р,(1)где С, и С , - концентрации г-го компонента в Фильтрате и концентрате,выраженные в единицах площади (высоты пиков на хроматограмме),П р к м е р 1. Калибровочнуюсмесь объемом 100 мл, представляющую собой раствор триптофана(М=24 тыс,), яичного (М=44 тыс.,) ичеловеческого сывороточного (М 67 тысальбуминов,-глобулина (М=160 тыс.),каталазы (М=240 тыс.) концентрациикаждого 0,4 мг/мл и частиц вирусао 3гриппа в концентрации 1 О 1/смфильтруют в ячейке с механическим перемешкванием через ацетатцеллюлвзнуюмембрану Биопор М,1, Средний диаметр пор 1000 А , После пропускания90 мд в Фильтрат (К=10) отбирают пробы Фильтрата и концентрата, которые 20анализируют на гель-хроматографической колонке 0,9 х 60 см, наполненной ультрагелем АсА, при скорости элюцки 4 см /ч. По гель-хроматограммамзфильтрата и концентрата согласно формулебыли рассчитаны коэффициенты задержания в зависимости от молекулярного веса (например, для веществ с мол.вес,59000-10000 Ч =0,9-0,95), По способу-прототипу расчетные данные были существенно занижены - вещества с указанными молекулярными весами преходили полностью.1В таких же условиях ка указанноймембране фильтровали вируссодержащуюаллактоисную жидкость с концентрациейвирусов 10 1/см , общим содержанием белка 1,6 мг/мл, содержанием оваль.бумина. 0,9 мг/мл и концентрировали в1 О раз. При этом концентрация овальбумииа возросла до 8 мг/мл, что со -ответствует=0,95, а белок с мол.мас. 60 тыс,дальток задерживался полностью, что согласуется с расчетнымиданными,П р и м е р 2. Калибровочную смесьобъемом 2000 см , представляющую со 3бой исходную культуральную жидкостьЯехгага Магсезсепз с концентрациейбактерий 2 х 0 1/см с добавлениемпепсина (М=35 тыс.дальтон) в концентрации 05 мг/мл, Фильтруют ка аппарате типа Фильтр-пресс, снабженном мембранами Биопор М, с обшей поверхиностью Фильтрации 4000 см", Последостижения 10-кратной степени концентрирования отбирают Фильтрат иконцентрат и анализировали их гельхроматографией ка содержание пепсина.По формуле. (1) был рассчитан коэффициент задержания пепсина, которыйбыл равным 0,03. На этом же аппаратепроводилась микрофильтрацкя реальнойкультуральной жидкости Беггаг:а Магсезсепз с концентрацией бактерий2 х 10 1/см, содержащей цслевои Фермент эндонуклеазу (ММ 30-36 тыс,дальтон). После достижения 10-кратной степени концентрировакия отбирали пробы фильтрата и концентрата,которые тестировались на содержаниеэкдокуклеазы по гидролизу высокополимерной РНК и по отношению активностей в фильтрате и концентрате согласно формуле (1) был определен коэффициент задержания экдокуклеазы9=0,05, который согласуется с Ч пеп247420 Содержание общего белк по Лоури,мг/мл,Штамм виру- са Содержание овалбумина мг/ млСтадия получения вакцины Рассчет Опыт Расчет Опыт А /Техас 2 После 11-кратно. го концентрирования 0,337-0,645 0,460 107-173 После диафильтрации, кратность12 Полуфабрикат 0,160-0,323 0,24.2 0,08-1,40,070 0,5 0,07+ Согласно ТУ И 2.14.149-78 на полуфабрикат гриппозной вакцины коцентрацияобщего белка не должна превышать 0,15 мг/мл, концентрация овальбуминамкг/мл,Составитель А.ПереверзеваТехред В.Кадар Корректор Г,Решетник Редактор Ы.Келемеш Заказ 4080/26 Тираж 490 По дписно е ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/5Производственно-полиграфическое предприятие,г.Ужгород,ул,Проектная,4 3 1 сина, имеющего близкую к эндонуклеазе молекулярную массу. П р и м е р 3. Калибровочную смесь объемом 2000 см, представляющую собой раствор молочного альбу- мина, яичного альбумина, человеческого сывороточного альбумина,-глобулина с начальными концентрациями по 0,5 мг/мл каждого и вируса грипо з па начальной концентрации 2 х 10 1/см фильтруют на аппарате типа фильтр- пресс, снабженного мембранами Биопор АМ й=350 Р. ) с рабочей поверхностью 400 см При различных степенях концентрирования, концентрациях белка (2- 6,7 мг/мл) и вируса гриппа (4 х х 101" 1/см") согласно методике приЭ мера 1 при скорости элюции 3,5 см /ч были определены коэффициенты задержания указанных белков, которые оказались равными: Ю,=0,200,05; 2= 0 50 11 Ч 0 580 10; Ч 0 67Х 0,11.По результатам калибровки мембраны Биопор-Ам (по коэффициенту задер жания овальбумина М,0,5+0,1 - лимитирующий фактор) были рассчитаны параметры процесса мембранной очисткивируссодержащей алантоисной жидкости, необходимые для получения стан О дартной гриппозной вакцины. Согласно расчетам было получено: степенькоцентрирования 10-15, кратность диафильтрации 10-12, Проведенная наработка опытных партий вакцин пв рас четной технологии позволила получить продукт, удовлетворяющий ТУкак по овальбумину, так и по общемубелку, и показала хорошее совпадение расчетных и экспериментальных 20 данных .Сравнение экспериментальных ирасчетных данных в процессе получения гриппозной вакцины приведено втаблице,