Способ определения активности лейцинаминотрансферазы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК АН ершенН по апс гц рр. 3(57 мии акт зы и превно стЦель ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(7) Ереванский институт уствования врачей(56) Сар 1 сс 1 по С,С. Кас 1 оюа 1Кпох Ч,Е. "Аззау оЕ 1 еисжйгапзйегазе 1 п гас йазиезпюга", Епгуае, 1978, ч. 23336,СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТ -АМИНОТРАНСФЕРАЗЫИзобретение относится к биох дназначено для определен и-лейцин аминотрансфер изобретения - ускорение 1 4 С О 1 М 33/48, А 61 В 1 О/О соба и определение активности 1, -леицин-аминотрансферазы ЛАТ) в биологических жидкостяхИсследуемый материал помещают в смесь, содержащую20-30 мМ-лейцина, 15-21 мМ -кетоглутаровой кислоты и 100-150 нМпиридоксальфосфата, Готовят еще контрольную пробу, содержащую все компоненты, кроме лейцина. Инкубациюпроб проводят при рН 7,6-8,2 в течение 1 ч, Затем добавляют раствор2,4-динитрофенилгидразина в 1 н НСи через 20 мин раствор едкого натра. Через 1 О мин фотометрируют. Расчет ведут по калибровочному графику,построенному по пировиноградной кислоте. По и2 ф, инкубацию проводят при концентрации А-кетоглутаровойкислоты 2,5-3,5 мМ и пиридоксальфосфата 100-150 нМ.Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к биохимии, и может быть использовано как в клинике, так и в эксперименте для определения активности-лейцин;2-оксоглутарат аминотрансферазы (Кф 2.6,1.6) в сыворотке или в плазме крови, моче, перитонеальной жидкости и в тканевых гомогенатах. 1 ль изоб 1 Ытения - ускорение способа и определение активности . -лей,цк 1 Н-аминотрансферазы (ЛАТ) в биолОгреческих жидкостях,, ФП р и м е р 1. Берут навеску поджелудочной железы 1 г, добавляют9 мл натрийфосфатного буфера рН 7,8,получая таким образом 10%-ный гомогент. 0,2 мл гомогента,добавляют винкубационную смесь, содержащую25 мМ-лейцина, 18 мМ 0-кетоглутаровой кислоты и 125 иМ пиридоксальФосфата (общий объем инкубационнойсмеси 0,8 мл). Одновременно готовятконтрольную пробу, содержащую всекомпоненты, кроме лейцина, Инкубацию опытной и контрольной проб проводят в термостате при 37 С 1 ч,оРеакцию останавливают кипячением втечение 5 мин (эта операция не обя;зательна и выполняется при необходимости дальнейюего хранения проб).Затем добавляют 0,5 мл 0,020 раство"ра 2,4-динитрофенилгидраэина в 1 н.НС и через.20 мин о 5 мл 0,4 н, раствора едкого натра и через 1 О минутФотометрируют при длине волны 510 нмпротив холостой пробы, содержащей0,8 мл дистиллированной воды, 0,5 мл0,02%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина и 5 мл 0,4 н. раствора едкого натра, Расчет ведут по калибровочному графику, построенному попировиноградной кислоте АктивностьЛАТ определяют по Формуле А=(С."С)хх 50 х 1,1, где А - активность ЛАТ вмикромолях М -кетоизокапроновой кислоты за 1 ч на 1 г ткани, С - количество пировиноградной кислоты, найденное по калибровочному графику вопытном образце, С -количество пи-ровиноградной кислоты в контрольномобразце, 50 - коэффициент пересчетана 1 г ткани," 1,1 - коэффициент пересчета от концентрации пировиноградной кислоты к концентрации 0(,-.кетоизокапроновой кислоты, найденный эмпирически,В данном случае А=(0,337-0,237)"х 50"1,1=5,5 мкмолей/г ткани/ч.П р и м е р 2, Берут 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови человека, инку бируют в присутствии 25 мМ-лейцина, 3 мМ-кетоглутаровой кислоты и 125 нР пиридоксальфосфата (общий объем пробы 0,7 мл) в натрийфосфатном буфере, рН 7,8 в термостате при О 37 С в течение 1 ч, Одновременнопроводят инкубацию контрольной пробы, не содержащей лейцина, Реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 0,02%"ного раствора 2,4-динитрофенил гидразина в 1 н, НС (при необходимости хранения проб проводят предварительно кипячение в течение 5 мин), оставляют на 20 мин, затем добавляют 5 мл 0,4 н. раствора едкого натра 20 и через 10 мин фотометрируют при длине волны 510 нм против холостой пробы содержащей 0,7 мл воды, 0,5 мл 0,020 раствора 2,4-динитрофенилгидразина и 5 мл 0,4 н, раствора едко го натра, По экстинкциям из калибровочного графика, построенного по пировиноградной кислоте, находят соответствующие концентрации пировиноградной кислотыи рассчитывают актив- ЗО ность ЛАТ по Формуле А=(С-С ) 10 1где А - активность ЛАТ в микромолях ж-кетоизокапроновой кислоты в 1 мл сыворотки (плаэ 35 мы) за 1 ч,С, - количество пировинограднойкислоты в микромолях, найденное для опытного образца;С - количество пировинограднойкислоты в контрольном образце,10 - коэффициент пересчета на1 мл сыворотки (плазмы );1,1 - коэффипиепт пересчета от пировиноградной к с 6-кетоизокапроновой кислоте, найденной эмпирически,В данном случае А=(0,285-0,240)хк 10 1,1=0,495 микромолей о.-кетоизокапроновой кислоты/мл/ч,П р и м е р 3, Берут 0;1 мл мочичеловека и проводят операции те же,что в примере 2, Расчет ведут потой же формуле, В данном случае А==(0,223-0,201) 1 О 1,1=0,242 микромолей/мл/ч.П р и м е р 4, Берут 0,1 мл перитопеальной жидкости и проводят-динитрофенилгидразонов кетокислот,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью ускорения способа, инкубацию проводят при рН 7,6-8,2, концентрации , -лейцина 20-30 мМ и Ы,-кетоглутаровой кислоты 15-21 мМ,2. Способ определения активности лейцин-аминотрансферазы по и. 1,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью определения активности фермента в биологических жидкостях,инкубацию проводят при концентрацийо-кетоглутаровой кислоты 2,5-3,5 мМи лиридоксальфосфата,00-150 нМ,те же операции, что и в примере 2,Расчет ведут по той же формуле.Вданном случае А=(0,345-0,200)Окк,1=1,595 микромолей/мл/ч,Формула изобретения. Способ определения активности лейцин-аминотрансферазы путем инкубации ткани в присутствии 1, -лейцина,сС -кетоглутаровой кислоты и пиридоксальфосфата с последующим добавлением 2,4-динитрофенилгидразина и фотометрическим определением 2,4 Составитель Н.ГуляеваРедактор Н,Горват Техред Л.Сердюкова Корректор АвЗимокосов Заказ 3283/45 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб, д. 4/5